沉默Ndfip2对肝癌细胞迁移和侵袭的影响*

张强， 罗彩云， 孙达权， 曾志锐， 郑志菊， 徐国强,3**

(1.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550025； 2.贵阳市第二人民医院 手术室， 贵州 贵阳 550023； 3.贵州医科大学第三附属医院 医学研究中心， 贵州 都匀 558000)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常见的人类恶性肿瘤之一，每年约有80万人因HCC而死亡，是死亡率较高的肿瘤[1]。近几年来肝癌患者通过手术切除、器官移植和化学治疗等方法有效地延长生命，然而即使经过有效的治疗，患者的总体生存率依旧较差，其1年和3年生存率分别为20%和5%，其中肿瘤的高复发率和转移率仍是导致HCC死亡的主要原因[2]。因此对HCC复发与转移发病的机制研究、寻求最佳分子疗法的靶标，可望成为有效治疗肝癌新的希望。Nedd4家族交互作用蛋白2(Nedd4 family interacting protein 2，Ndfip2)是Nedd4家族交互作用蛋白中的一员，可与Nedd4家族成员结合，能够激活E3泛素连接酶，影响泛素化进行。研究发现Nedd4在肿瘤细胞上皮-间充质转化(EMT)过程中起着至关重要的作用，Nedd4的下调导致EMT表型部分回复到间充质-上皮转化(MET)表型特性，在肿瘤细胞的转移过程中起关键作用[3]。为了进一步探究Ndfip2对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响，本实验采用免疫组化En Vision染色法和蛋白印迹法检测Ndfip2在肝癌组织和和肝癌细胞SMMC-7721、HepG2中的表达，通过Ndfip2 小干扰RNA(small interfering RNA，si-Ndfip2)靶向沉默肝癌细胞中Ndfip2的表达，探究Ndfip2对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响及作用机制，为肝癌的治疗提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

1.1.1细胞株 人正常肝细胞株LO2、人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2均购自中国科学院昆明细胞库。

1.1.2肝癌及其癌旁组织标本 病理科生物样本库中16例肝癌手术患者(未经化疗)的肝癌及其癌旁组织(距离肝癌组织边缘2 cm处)标本，收集样本进行研究之前，获得患者签署知情同意，本研究得到医院伦理委员会批准。

1.1.3试剂 RPMI-1640培养基(批号8121283)和青-链霉素购自美国HyClone公司，新生牛血清(FBS) 购自四季青公司(批号20010503)，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司，PVDF膜购自Millipore公司(批号R0BB23468)，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自北京索莱宝生物公司，BCA蛋白浓度定量试剂盒购自上海碧云天生物技术公司(批号20200519)，RIPA裂解液和PMSF酶抑制剂购自武汉博士德生物公司(批号20200804)，高敏ECL曝光液购自上海碧云天生物技术公司(批号P0018AS-2)，兔抗人Nedd4家族交互作用蛋白2(Nedd4 family interacting protein 2，Ndfip2)多克隆抗体购自美国Affinity公司(批号DF2596)，兔抗人E-钙黏蛋白(E-cadherin,批号AF0131)、兔抗人N-钙黏蛋白(N-cadherin,批号BS2224)、兔抗人波形蛋白(Vimentin)多克隆抗体购自武汉三鹰公司(批号10366-1-AP)，兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH)多克隆抗体购自巴傲得生物科技有限公司(批号YM32215)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(二抗)购自武汉三鹰公司(批号AA122028)，si-RNA Ndfip2序列由上海吉玛基因公司合成，LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司(批号2150081)。

1.2 方法

1.2.1Ndfip2表达 肝癌组织和癌旁组织标本采用EnVision染色法，染色严格按照试剂盒说明书进行。每张切片由两位病理医师在高倍镜(×400)随机选取5个视野进行单独评分：染色强度分为0分(阴性)、1分(弱阳性)、2分(阳性)、3分(强阳性)，特异性阳性染色分为0分(<5%)、1分(6%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)和4分(>75%)；最终分数为染色强度得分和特异性阳性染色得分乘积表示， 0～4分为基因低表达组、 4分以上为高表达组。

1.2.2细胞培养 人正常肝细胞株LO2、人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2用RPMI-1640培养基(10%FBS、1%青-链霉素)、37 ℃、5% CO2培养箱内进行常规培养，当细胞融合率为70%～80%时，用0.25%胰酶消化并传代、进行后续的实验，此4种细胞均为贴壁生长。

1.2.3Ndfip2 si-RNA转染肝癌细胞 将细胞按1×106个/孔，铺于12孔板待长到50%～70%时对细胞进行瞬时转染，转染前2 h将12孔换成新鲜无血清RPMI-1640培养基，取siRNA(1 D)，瞬时离心后加入DEPC125 μL处理水配成工作溶液。取两个1.5 mL离心管，一管加入4 μL Lipo2000与无血清RPMI-1640培养基200 μL后混匀、另一管加入4 μL siRNA与200 μL无血清RPMI-1640培养基后混匀，室温静置5 min，混匀上述两个离心管中的液体，室温静置20 min，实验组中每孔各加入204 μL混合液，然后每孔补充796 μL无血清RPMI-1640培养基；继续培养6 h后换成含20 % FBS的新鲜RPMI-1640培养基。Ndfip2特异性si-RNA的正义链序列为5′-GGAAGAGUGUCCACCAACATT-3，反义链序列为5′-UCUUGGUGGACACUCUUCCTT-3′；阴性对照的正义链序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反义链序列为5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。

1.2.4实验分组 SMMC-7721细胞的 Ndfip2-siRNA沉默对照组(NC)和Ndfip2沉默组(si-Ndfip2)，HepG2细胞的Ndfip2-siRNA沉默对照组(NC)和Ndfip2沉默组(si-Ndfip2)。

1.2.5划痕实验检测肝癌细胞的迁移 将转染完成的各组细胞按每孔1×106个细胞铺于12孔板中，待细胞生长至100 %密度时在孔中央使用10 μL的无菌枪头做“十字”划痕，PBS清洗3次以去掉悬浮的细胞，加入不含血清的RPMI-1640培养液1 mL继续培养，分别在0即刻、24 h于显微镜下观察细胞的状态并拍照。采用Image J软件测量迁移面积，并进行统计学分析。计算细胞迁移率，细胞迁移率(%)=(总面积-空白面积)/总面积×100%。

1.2.6Transwell实验检测肝癌细胞的迁移和侵袭 迁移实验：收集转染完成的各组细胞，按每室1×105个细胞制成无血清RPMI-1640悬液200 μL，铺于8 μm孔径Transwell小室，后将小室移至含10% 血清培养液600 μL的下室中，继续培养细胞；48 h时取出，用4 %的多聚甲醛溶液固定细胞10 min，0.1%结晶紫染色20 min、双蒸水冲洗浸泡数次，轻柔去除上层的细胞。经烘箱干燥后，置于光学显微镜40倍镜下随机采集5个视野细胞计数，以此表示细胞迁移能力。侵袭实验：预先以4 ℃预冷的无血清RPMI-1640培养基和Matrigel按11 ∶1的体积比例稀释后，每孔100 μL，均匀铺在上室，放入培养箱中静置2 h使其干成胶状；取出小室，弃上清液后加PBS于上室和下室平衡15 min，然后除去PBS，剩余步骤同Transwell迁移实验。

1.2.7Western blot检测Ndfip2、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表达 收集各组细胞，经RIPA裂解液裂解，使用BCA定量法进行定量，配制10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳，每孔蛋白上样量为10 μL；将蛋白转至PVDF膜，37 ℃、5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(兔抗人Ndfip2、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin)4 ℃孵育过夜、洗膜(1×TBST，3次，5 min/次)，二抗[辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔(所有二抗体积稀释度均为1 ∶2 000)]室温孵育2 h、洗膜，在膜上均匀铺上曝光液ECL，在凝胶成像系统内测定结果，用Quantity One系统分析目的条带并获取目的条带的灰度值进行分析。本实验使用GAPDH作为蛋白质标准化的内参，用目的蛋白的灰度值与内参蛋白的灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 Ndfip2表达

免疫组化结果显示，与癌旁组织比较，肝癌组织中Ndfip2表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1A～B。蛋白印迹法结果显示，与正常肝细胞LO2比较，Ndfip2在肝癌细胞SMMC-7721、HepG2表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1C～D。

注：A、B为Ndfip2在肝癌组织和癌旁组织的表达(1HC，×400)，(1)与癌旁组织比较，P<0.05；C、D为Ndfip2在正常肝细胞和肝癌细胞中的表达(Western blot)，(1)与LO2细胞比较，P<0.05。图1 Ndfip2在肝癌组织和细胞株中的表达Fig.1 The expression of Ndfip2 in HCC tissues and cell strains

2.2 Ndfip2低表达细胞株

Western blot法结果显示，si-Ndfip2组SMMC-7721和HepG2细胞中的Ndfip2的表达水平较NC组细胞显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2A～C。提示Ndfip2低表达肝癌细胞株构建成功。

注：A、B为Western blot条带灰度结果，C为相对定量结果； (1)与NC组比较，P<0.05。图2 SMMC-7721和HepG2细胞的Ndfip2低表达细胞株(Western blot)Fig.2 SMMC-7721 and HepG2 cells with low expression of Ndfip2 (Western blot)

2.3 Ndfip2对肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响

划痕实验结果显示，与NC组比较，si-Ndfip2组SMMC-7721和HepG2细胞的迁移面积均减小, 差异有统计学意义(P<0.05)。见图3A～B。Transwell实验结果显示，与NC组比较，si-Ndfip2组SMMC-7721和HepG2细胞的迁移细胞数及侵袭细胞数均减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3C～F。

注：A 、B为划痕实验结果(×40)，C、D为Transwell迁移实验结果(×40)，E、F为Transwell侵袭实验结果(×40)；(1)与NC组比较，P<0.05。图3 Ndfip2对肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响Fig.3 The effect of Ndfip2 on the migration and invasion of HCC cells

2.4 沉默Ndfip2对肝癌细胞E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白的影响

倒置显微镜下观察NC组、si-Ndfip2组SMMC-7721和HepG2细胞的形态学变化，结果发现与NC组比较，si-Ndfip2组部分SMMC-7721和HepG2细胞形态发生改变，由长梭形或纺锤形转变为规则的铺路石样，形态往上皮样转化。见图4A。蛋白印迹法结果显示，与NC组比较，si-Ndfip2组SMMC-7721和HepG2细胞的E-cadherin蛋白表达显著上调；而N-cadherin和vimentin蛋白表达则显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4B～E。

注：A为倒置显微镜观察肝癌细胞形态变化(×400)，B～E为SMMC-7721Western blot结果图；(1)与NC组比较，P<0.05。图4 Ndfip2低表达后EMT标记蛋白表达情况Fig.4 The expression levels of EMT marker protein after Ndfip2 low expression

3 讨论

肝癌是全球最为普遍的恶性肿瘤和主要致死原因之一。尽管在肝癌的治疗方法方面取得了一些进展，但切除肝癌后的转移和复发率依然很高，这是导致临床治疗失败和患者死亡的主要原因之一[4-5]，因此探寻并阐明肝癌发展和转移的机制对于肝癌的临床治疗和防治极其重要，这也是人们一直潜心研究的重要课题和努力方向。泛素化是一种翻译后修饰，影响多种细胞过程，对于细胞体内稳态的维持至关重要。在三酶级联反应中，E3泛素连接酶通过募集底物并促进或直接催化泛素转移至靶标，因而在很大程度上决定了泛素化反应的特异性[6]。研究发现E3泛素连接酶的遗传改变，异常表达或功能障碍是人类癌症发生和发展的原因[7]。例如E3泛素连接酶NEDD4家族，研究发现，NEDD4在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系中的过表达促进了NSCLC细胞生长，而NEDD4的沉默则显着抑制了NSCLC细胞在体内和体外的增殖[8]。Ndfip2，全称Nedd4家族交互作用蛋白2，可与Nedd4家族成员蛋白的 WW 结构域结合并其家族成员，是E3泛素连接酶Nedd4家族的激活因子，影响蛋白质泛素化的进程[9]。最新研究发现其同源蛋白质Ndfip1可以通过AKT/mTOR介导的Warburg效应促进人肝癌细胞SMMC-7721的转移[10]，然而Ndfip2对肝癌的作用却鲜有报道，因此本课题组通过免疫组化和蛋白印迹法检测了肝癌组织和肝癌细胞SMMC-7721和HepG2中Ndfip2 的表达，实验结果表明与癌旁组织和正常肝细胞LO2相比，肝癌组织和肝癌细胞SMMC-7721和HepG2中Ndfip2表达显著升高。为了进一步研究Ndfip2对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响，本实验通过Ndfip2 si-RNA转染SMMC-7721和HepG2靶向沉默肝癌细胞中Ndfip2表达，通过划痕实验和transwell实验评价Ndfip2对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响，结果显示相对于NC组，si- Ndfip2组迁移面积和迁移侵袭细胞数均显著减少，提示沉默Ndfip2显著抑制肝癌细胞SMMC-7721和HepG2的迁移和侵袭能力。

EMT是上皮细胞向间质细胞表型的转变过程，也是上皮细胞失去极性并获得迁移和侵袭能力的过程。大量实验表明，EMT的生物学过程被认为是致癌作用的关键标志，靶向EMT途径是一种有潜力的癌症治疗策略[11]。EMT的标志是上皮标志物表达的丧失，通常由E-钙黏蛋白(E-cadherin)的存在来表明，而间充质标志物表达(如N-cadherin和Vimentin)的增加伴随着侵袭性表型的改变[12]。本实验在倒置显微镜下观察NC组和si-Ndfip2组SMMC-7721和HepG2细胞的形态学变化，发现SMMC-7721和HepG2细胞沉默Ndfip2后，部分肝癌细胞形态及体积缩小，呈现上皮样改变。采用蛋白印迹法检测结果显示当SMMC-7721和HepG2细胞中Ndfip2低表达后，E-cadherin的蛋白表达显著上调,而N-cadherin和vimentin的蛋白表达则显著下调，提示沉默Ndfip2可能抑制EMT的发生。