三氧预充回收自体血后的红细胞流变学和功能变化研究

周燕琴，吴琴丽，高特生

术中回收自体血并回输已广泛应用于心脏外科、大血管外科、骨科及妇产科等多个领域，在急性大出血的抢救、异体输血并发症的预防及节约血源方面均发挥了重要作用[1]。无论是洗涤式还是非洗涤式自体输血，术中血液回收过程中由于自体血和管道的接触、吸引器的吸引力作用、洗涤及离心等机械作用，红细胞的破坏在所难免[2]。而红细胞流变学和功能的变化，均可能导致红细胞运氧能力下降，甚至引发严重输血后并发症，影响手术安全性[3]。因此，在提高术中自体血回收率的基础上，如何保护好红细胞的质量和功能，也是目前临床关注的重点。三氧又称臭氧，是由三个氧原子组成的强氧化剂，具有氧化、抗炎及镇痛等作用，已在多种疾病和领域得到了广泛应用[4]。最新研究显示，三氧能够提高红细胞内三磷酸腺苷（ATP）含量与2,3-二磷酸甘油（2,3-DPG）水平[5]，故采取三氧预充回收自体血有望提高红细胞质量，延长安全保存时间。本研究对三氧预充回收自体血后红细胞流变学和功能的变化进行探索，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年2月至2020年10月浙江中医药大学附属嘉兴市中医医院收治的拟行全身麻醉下手术、术中需自体血回收的患者。入组标准：（1）美国麻醉师协会（ASA）麻醉危险度分级I～II 级[6]；（2）术前6 个月内无异体血输注史；（3）经详细介绍研究内容后，了解研究内容并自愿参与研究。排除标准：（1）合并恶性肿瘤、血液系统或慢性失血性疾病；（2）合并高脂血症、低血钙、低血糖及低血压；（3）合并血小板减少、凝血功能障碍；（4）合并中重度贫血及肝肾功能异常。共纳入符合条件的患者45例。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方案 所有患者入室后即行常规心率、心电、血压及血氧饱和度监测，完成外周静脉置管。行静吸复合气管插管内全身麻醉，于右侧锁骨下或颈内静脉穿刺置管，穿刺桡动脉，持续监测动脉压，同时监测呼气末二氧化碳分压及吸入麻醉药物浓度。术中芬太尼、丙泊酚、七氟烷与顺式阿曲库铵维持麻醉。患者手术及麻醉均由同组医师完成。

1.2.2 自体血回收 采用京精自体血液回收机（3000P 型）实施术中血液回收，包括抗凝、收集、过滤、分离及洗涤[7]。（1）抗凝：将2500U肝素加入500ml0.9%氯化钠注射液中，以50ml肝素抗凝剂填充回收管道及回收罐内过滤膜，以避免回收血直接接触管壁和过滤膜所致凝血，然后选择适当的速度混合回收血液，避免血液凝聚。（2）收集：切皮后开始血液回收，回收血液包括术中出血、体内出血，将回收血和抗凝剂比例调整为50∶1。（3）过滤：选择孔径40 m的过滤膜，将回收期间的异物滤出，过滤后的自体血存放于专用储血罐中。（4）分离：将离心分离泵转速设定为5600r/min，离心分离回收自体血，当血细胞出现血层时，设备自动暂停血液进入。（5）洗涤：使用0.9%氯化钠注射液对回收的血细胞进行清洗，清洗转速400 r/min，用2 000 ml 洗涤液洗涤回收的血1 单位，以洗去受损的血细胞等。（6）储存：将洗涤完毕的红细胞悬液排放到血液储存袋中储存。

1.2.3 三氧处理 从储血袋内抽出30ml红细胞悬液注入专用的抗氧化的三氧自体血血袋，将现场制备的25 g/ml的30ml三氧气体注入三氧血袋[8]，并按同一方向缓慢的圆周运动将自体血与三氧混合转动约5 min。立即抽出5 ml自体血（T1），30 min 再抽出5 ml 自体血（T2），60 min抽出5 ml 自体血（T3），90 min 抽出5 ml自体血（T4），120 min 抽出5 ml 自体血（T5），150 min 抽出5 ml 自体血（T6）。同时采集储血袋三氧未处理的5 ml 自体血（T0）。血液离心分离前从储血罐采集5 ml 原始血液。

1.3 观察指标 所有采集血液立即以肝素钠（10 IU/ml）抗凝，置于EP 管送化验室检测分析。全部血样测定红细胞流变学参数、ATP 及2,3-DPG。其中红细胞流变学参数包括红细胞最大变形指数（DImax）、红细胞综合变形指数（IDI）、红细胞取向指数（DIor）及红细胞小变形指数（DId）。

1.4 统计方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用 检验。＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红细胞流变学参数变化 三氧处理血T3、T4、T5、T6 时点DImax、DId 均较T1 时点下降（均＜0.05），T4、T5、T6 时点DIor 均较T1 时点下降（均＜0.05）；原始血液T2、T3、T4、T5、T6 时点DImax、IDI、DIor、DId 均较T1 时点下降（均＜0.05）；三氧处理血T2、T3、T4、T5、T6时点DImax、IDI、DIor、DId 均高于原始血液同时点水平（均＜0.05）。见表1～4。

表1 DImax 变化比较

2.2 红细胞功能参数变化 三氧处理血T3、T4、T5、T6 时点ATP、2,3-DPG 含量均较T1 下降（均＜0.05），原始血液T2、T3、T4、T5、T6 时点ATP、2,3-DPG含量均较T1 下降（均＜0.05）；三氧处理血T2、T3、T4、T5、T6 时点ATP、2,3-DPG 含量均高于原始血液同期水平（均＜0.05）。见表5～6。

表2 IDI 变化比较

表3 DIor 变化比较

表4 DId 变化比较

表5 ATP 变化比较 mol/gHb

表6 2,3-DPG 变化比较 g/L

3 讨论

红细胞的功能是携带和供给氧气，也是人体内重要的血细胞。红细胞的变形能力是决定体内红细胞功能和存活时间的重要因素[9]。输血后，如果红细胞质量和功能下降，输血后临床效果不佳，甚至导致输血不良反应[10]。由于自体血与管道的接触、吸引器的吸引、冲洗及离心等机械作用，红细胞的破坏不可避免。大量研究表明，表面清洗后回收的红细胞变形能力明显下降[11-12]，这可能主要是由于不同直径的人工血管内红细胞出现异常漩涡、泵挤及离心分离等，对红细胞形成剪切力，导致变形减小和黏附力增强。在恢复过程中，血液不断稀释，胶体渗透压下降，使水分不断转移到细胞中，引起细胞肿胀，细胞表面积体积比下降，双凹盘状消失，导致红细胞变形能力下降，甚至溶血。在血液回收过程中，通过不同途径产生大量的氧自由基，造成脂质过氧化损伤。红细胞膜脂不饱和脂肪酸对氧自由基氧化极为敏感，容易产生细胞毒性脂质过氧化物，膜蛋白和血红蛋白受损，红细胞流变学降低，导致红细胞变形能力下降。此外，术中回收的血液经离心清洗后得到的红细胞悬液暂时储存在输血袋内，麻醉医师根据术中具体情况适时回输，因此回收的红细胞悬液有时可能需要在室温下保存一段时间，甚至长达3～4h，如何让回收的红细胞悬液在体外较长时间保持稳定的双凹圆盘形结构，关系到回收的红细胞回输后的效果及安全性[13]。

本研究结果显示未经处理的原始血液回收后，其DImax、IDI、DIor 及DId均持续下降，意味着红细胞变形性逐渐降低，携氧能力持续减弱；同时，原始血液的ATP、2,3-DPG 亦随时间呈下降趋势，说明红细胞活性下降，能量物质减少，储存损伤逐渐加剧。三氧在治疗高血脂、心脑血管疾病、周围神经疾病、腰椎间盘突出、皮肤疾病和疼痛等疾病方面已经取得了不错的成果，这与三氧的以下机制有关[14]：（1）三氧能与血液、组织液、淋巴及尿液等体液接触，产生两种强氧化剂，即单氧原子（O）和过氧化氢（H2O2）。单个氧原子的活性极强，不仅能够导致2,3-DPG 含量上升，还可造成红细胞对氧的亲和力下降，此时红细胞的携氧能力上升，从而更容易向需氧组织释放氧；（2）三氧可激活2,3-DPG进血红蛋白释放氧，提高患者血中的ATP 含量；（3）三氧可使作为自由基清除剂的酶产生增加及活力增高；（4）三氧能直接改善红细胞膜表面电离子排序，可以使细胞膜表面负电荷增加，红细胞的沉降率也随之降低，从而减低或清除红细胞的凝聚，改善红细胞的柔顺度和伸展性，提高血液携氧能力。

本研究结果示在获得自体血并经三氧处理后的30～60 min 内，三氧处理血的DImax、IDI、DIor、DId、ATP 及2,3-DPG均未见明显变化，且在血样取出后的各个时点，其红细胞流变学、功能均优于原始血液，显现出三氧预充回收自体血在短时间内保护红细胞变形性、活性、能量及携氧能力方面的积极作用。三氧自体血回输技术是采用外周静脉采集的自体血为原料，在体外通过与精确的三氧气体反应，再在短时间内（约15min）回输体内，可以认为，在此时间段内，三氧处理血能够保证红细胞储存质量，减少红细胞储存损伤，保证红细胞回输的效果与安全性。