人结直肠癌组织Claudin-1、Claudin-7 蛋白的表达与患者预后的关系

曹跃鹏，袁旦平，庞洪双，赵振亚，李璐，陶勇

结直肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居所有恶性肿瘤发病率的第3 位，死亡率位居第2 位[1]。关于结直肠癌恶性生物学行为的分子生物学机制尚不十分清楚,但普遍认为其涉及多基因、多步骤的调控过程。随着研究的深入，已有研究表明细胞间连接结构的破坏损伤及细胞间黏附力的减低或丧失与肿瘤的发生、浸润及转移密切相关[2]。因此，紧密连接蛋白基因家族成为研究的热点与难点。多项研究表明，Claudin 蛋白是紧密连接的主要组成成分，尤其是Claudin-1 及Claudin-7 在细胞的异常增生、肿瘤的发生及发展等方面起着重要的作用[3-4]。目前，其在结直肠癌中的表达及作用研究有限，无明确论断。本研究采用免疫组织化学（免疫组化）检测结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表达，结合患者的临床及随访资料，旨在分析结直肠癌组织Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表达以及与患者预后的关系。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012 年1 月至2016 年1 月宁波市第一医院肛肠外科收治的行手术切除并经病理证实的88例结直肠癌患者的术后标本及其基本临床资料。其中男51例，女37例；年龄41～79 岁，平均年龄（60.3±18.1）岁；结肠癌49例，直肠癌39例。所有患者均排除心、肝、肾等重要器官疾病，无合并严重内科疾病，无其他部位原发肿瘤及转移瘤。所有病例术前均未经任何抗肿瘤治疗，术后对所有患者进行随访，随访终止时间为2021 年1 月。研究的主要终点事件为总生存时间（OS），其定义为手术之日至出现任何原因引起的死亡时间或随访终止，非肿瘤相关性死亡归为失访。

1.2 方法

1.2.1 实验材料 兔抗人Claudin-1 多克隆抗体（上海煊翎生物科技有限公司）；兔抗人Claudin-7 多克隆抗体（上海煊翎生物科技有限公司）；免疫组化试剂盒（上海煊翎生物科技有限公司）；DAB（氨基联苯胺）显色试剂盒（浓缩型）：北京西雅金桥生物技术公司。所需标本均用4%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，取出浸泡于95%乙醇中的清洁载玻片，涂布多聚赖氨酸干燥后制作4m厚度组织切片，行免疫组化染色。

1.2.2 免疫组化（LP法）88例配对的癌组织及癌旁组织标本，经常规脱蜡水化，枸橼酸缓冲液高温修复抗原，PBS 漂洗3 次后以0.3%过氧化氢-甲醇孵育10 min，清除内源性的过氧化物酶活性，PBS漂洗4 次后滴加5%BSA 封闭液，室温孵育60 min 倾去，滴加适当比例稀释的一抗，冰箱4 ℃过夜。PBS 漂洗3 次后，再滴加二抗，室温孵育20 min；PBS 漂洗3 次，再滴加试剂SABC 室温孵育20 min；PBS 漂洗4 次，DAB 显色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，PBS 代替-抗作阴性对照。结果判断：在10 个高倍显微镜下观察，以细胞膜和/或细胞质中出现黄棕色着色颗粒或团块为 Claudin-1 及Claudin-7 阳性细胞。低表达为阳性细胞数＜10%；高表达为阳性细胞数≥10%。

1.3 统计方法 运用SPSS 15.0 统计软件进行分析，Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表达与结直肠癌患者的临床病理参数的关系采用2检验。采用法计算生存率，以法检测生存曲线的差异。采用单因素及多因素回归分析法分析Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表达与患者预后的关系。＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织及癌旁不同距离组织中Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表达的比较 Claudin-1及Claudin-7 蛋白阳性黄褐色颗粒主要分布在细胞膜或细胞质中（封二彩图1～4）。Claudin-1 蛋白在癌旁组织中呈高表达22.72%（20/88），在结直肠癌组织中高表率达80.68%（71/88）；Claudin-7 蛋白在癌旁组织中高表达90.91%（80/88），在结直肠癌组织中低表达率达45.45%（40/88）；差异均有统计学意义（2=59.18、29.33，均＜0.05）。

2.2 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表达与结直肠癌患者的浸润深度、分化程度、淋巴转移、TNM 分期均有关（均＜0.05），而与性别、年龄、肿瘤大小及位置、血清CEA 等均无关（均＞0.05），见表1。

表1 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系 例

2.3 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表达与结直肠癌患者的生存分析 随访10～60（中位数43）个月，其中失访11例（包括非肿瘤相关死亡病例）。Claudin-1蛋白阳性表达组与Claudin-7 蛋白阴性表达组5 年总生存率分别为27.91%（19例）与49.86%（8例），差异有统计学意义（2=9.59＜0.05）。Claudin-7蛋白阳性表达组与Claudin-7 蛋白阴性表达组5 年总生存率分别为48.70%（23例）与27.90%（10例），差异有统计学意义（2=8.70＜0.05），见封二彩图5～6。

2.4 Claudin-1 及Claudin-7 蛋白表达与结直肠癌患者的影响因素分析 Cox 回归模型单因素及多因素显示，TNM 分期晚、浸润程度深、淋巴结转移和Claudin-1 蛋白阳性表达及Claudin-7 蛋白阴性表达均是结直肠癌患者术后总生存期的独立高危因素（均＜0.05）。见表2。

表2 结直肠癌患者总生存预后影响因素的预后分析

3 讨论

结直肠癌是全球死亡率较高的恶性肿瘤。尽管对于结直肠癌的发病机制的研究已经取得了较好的进展；但要阐明其分子机制仍然有大量的工作需要完成，而分析结直肠癌组织与正常组织中的蛋白表达水平差异是研究其发病机制的重要途径之一。Claudin 包含NH2-和COOH-端位于细胞内部，C 末端可与内层的蛋白分子连接；细胞外的肽链可以形成两个跨膜的环，这两个环可以和邻近的其他细胞的同种类型环相接触而行使功能[5]。现已证实，Claudin 蛋白是构成紧密连接的骨架蛋白，参与维持细胞极性和渗透性，黏膜屏障及信号传导功能，其功能改变与多种肿瘤发生密切相关[6]。

结直肠癌与Claudin 紧密连接蛋白是近年来研究的热点，其异常表达可能参与结直肠癌发生发展及转移的过程。大量证据表明，由于组织特异性不同，Claudin 种类在癌组织中表达量也不同[7]。本研究从临床表型入手，以较大的样本量（88例结直肠癌患者临床组织），通过免疫组化实验方法分析Claudin-1 及Claudin-7 蛋白的表达情况。本文结果表明Claudin-1 在癌组织中高表达，而Claudin-7 处于低表达。本研究免疫组化实验结果显示阳性黄褐色颗粒主要分布在细胞膜或细胞质中。对比患者的临床信息后发现，Claudin 蛋白更多地与肿瘤浸润转移相关，提示Claudin蛋白可能通过改变细胞间黏附力，促使肿瘤细胞极性的生长失控。因此，本研究也尝试用临床资料来分析Claudin 蛋白与肿瘤进展及预后的关系；结果显示，Claudin-1 蛋白高表达及Claudin-7 蛋白低表达与分化程度、淋巴结转移、TNM分期及浸润程度相关，说明该蛋白与结直肠癌恶性程度相关。目前认为，在肠癌组织中Claudin-1过表达机制的研究中发现，其表达可使E-钙黏连蛋白受抑制，从而使-catenin 蛋白/T 细胞特异性转录因子信号通路表达上调，促使肿瘤的发生、发展[8]。亦有研究显示，Claudin-1 过表达能明显诱导基质金属蛋白酶-2（MMP-2），引起紧密连接蛋白结构和功能破坏，导致组织黏附力下降或黏附分子破坏。继而使肿瘤细胞易脱离原发灶，黏附于周围间质或正常细胞基膜、血管、淋巴管。肿瘤细胞迁涉力侵袭力增加促进肿瘤浸润，最终导致淋巴结转移[9]。此外，在肿瘤组织中Claudin-7蛋白表达水平降低或不表达，与发生肿瘤时，紧密连接结构破坏，细胞间黏附性降低或丢失，失去限制肿瘤细胞的营养和相关生长因子供应的作用，而使肿瘤细胞缺乏分化，侵袭力增强[10]。Claudin-7 蛋白的表达下调促进上皮-间质转化，并促进肿瘤的进展[11]。因此，其可能是结直肠癌的一种潜在的抑制剂。

本研究结合Cox 回归分析显示，Claudin-1 高表达及Claudin-7 低表达是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素。另有研究显示Claudin-1 水平的升高与肿瘤TNM分期、淋巴结转移及肿瘤复发显著相关，是影响总体存活率的独立预后因素，可作为潜在的预后因素[12]。Philip 等[13]研究发现，Claudin-7 表达和调控，与侵袭、转移和上皮-间质转化之间的相关性，参与结直肠癌进展，影响预后[13]。本研究中，笔者还对Claudin-1 及Claudin-7的表达强度与结直肠癌生存时间的关系进行了观察分析，结果显示Claudin-1 蛋白高表达组与Claudin-7 蛋白低表达组5 年总生存率分别为27.91%和49.86%，且差异有统计学意义（ﾞ＜0.05）。相反，Claudin-7 蛋白阳性表达组与Claudin-7 蛋白阴性表达组5 年总生存率分别为48.70%与27.90%，差异有统计学意义（ﾝ＜0.05）。

综上所述，Claudin-1 高表达及Claudin-7 低表达可以促进结直肠癌的发生发展，与结直肠癌的侵袭和转移有关，并影响患者预后，对判断手术后结直肠癌患者预后具有较好的参考价值。