川芎嗪对脓毒症小鼠肝脏的保护作用研究

张益维，王珏，朱浩，黄长顺，杨秋红，韩杨杨

脓毒症是感染、创伤及烧伤等临床危急重症患者的常见并发症，已成为危重病患者死亡的首要原因[1]。肝脏在脓毒症的发生、发展中发挥着至关重要的调节作用[2]，肝细胞在脓毒症时可以迅速地清除机体过量的炎症介质，从而有效地调控机体的炎症反应[3]。研究表明，肝功能障碍或肝脏病变的患者发生感染性疾病如脓毒症等的风险明显增加[4]，脓毒症休克患者并发肝功能障碍者病死率高达84.0%[5]。川芎嗪已被证实对机体免疫系统具有调节作用，减少脂质过氧化物的生成等作用[6]。本研究旨在通过动物实验观察川芎嗪对脓毒症小鼠肝脏的保护作用。报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物模型和分组 32 只试验用小鼠，均为雄性8 周龄野生型C57BL/6J小鼠，体质量19～22 g，采购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，合格证号：20170005013227。按体质量编号后采用随机数字表法分为4组，分别为假手术+0.9%氯化钠注射液组（A 组）、假手术+川芎嗪组（B 组）、肠穿孔术（CLP）+0.9%氯化钠注射液组（C 组）和CLP+川芎嗪组（D 组），各8 只小鼠。本试验已通过杭州赫贝科技有限公司试验动物伦理委员会的伦理审查。

1.2 方法 CLP 造模方法：所有小鼠于手术前12 h 禁食、禁水，采用4%水合氯醛（0.1 ml/10g）麻醉后，C、D组小鼠于腹中线处进行1 cm 左右的开口，游离盲肠，并于末端进行结扎，采用16号针在盲肠末端0.5cm处，穿刺并挤出少许粪便后缝合。A、B组小鼠只进行开腹不结扎盲肠。所有小鼠在开腹后均注射0.2 ml 0.9%氯化钠注射液。干预措施：B、D 组小鼠于术前30min 小鼠尾静脉注射20mg/kg的盐酸川芎嗪注射液，A、C 组小鼠于术前30 min 注射等量的0.9%氯化钠注射液。

1.3 观察指标（1）观察4 组小鼠术后7 d 存活率。（2）血液生化检测。取术后48 h眼眶血，EDTA抗凝处理后，4 ℃，5 000 r/min 离心10 min，取血浆置入血生化仪检测丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、肿瘤坏死因子-（TNF-）、白介素-1（IL-1）及白介素-6（IL-6）。（3）采用ELISA 法检测肝组织匀浆中IL-6 和TNF-表达，以及肝组织内髓过氧化物酶（MPO）的活性。（4）镜下观察拍照，对样本的病理变化作综合性描述，并对样本进行病理评分。按炎细胞浸润范围评分：0分，无炎细胞或极少数炎细胞浸润；1 分，＜25%，轻微炎症；2 分，26%～50%，轻度炎症；3 分，51%～75%，中度炎症；4 分，＞75%，重度炎症。以5 个视野的平均值作为该样本的最终评分，最终结果以均数±标准差来表示。

1.4 统计方法 数据采用SPSS 22.0 软件分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用检验，多重比较采用 检验；生存率比较采用检验。＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后7 d生存率比较 A、B组小鼠CLP 术后7 d 内无死亡，生存率显著高于C 组和D 组（2≥5.02，均＜0.05）；D 组术后7 d 生存率显著高于C 组（2=9.21＜0.05）。见封二彩图7。

2.2 4 组小鼠术后7 d 生化指标和炎症因子检测 B组小鼠ALT、AST、TNF-、IL-1 及IL-6 均显著低于A 组（≥5.22，均＜0.05）；C 组小鼠上述指标均显著高于A 组（≥4.90，均＜0.05）；D 组小鼠上述指标均显著低于A、C 两组（≥4.68，均＜0.05），除TNF-外，其余指标均显著高于B 组（≥4.41，均＜0.05）。见表1。

表1 4 组小鼠术后7 d 生化指标和炎症因子检测

2.3 4 组小鼠肝组织IL-6、TNF-及MPO 表达比较 B 组与A 组3 项指标差异均无统计学意义（≤1.20，均＞0.05）；C 组3 项指标均显著高于B 组（≥4.11，均＜0.05）；D 组IL-6 及TNF-水平低于C 组（≥3.96，均＜0.05），MPO 水平差异无统计学意义（=1.85＞0.05）。见表2。

表2 4 组小鼠肝组织IL-6、TNF-及MPO 表达比较 pg/ml

2.4 病理结果（1）HE 染色结果示，A组及B 组小鼠肝细胞未见变形和坏死，肝窦清晰，未见炎症浸润。C 组小鼠肝细胞肿胀，中央静脉存在严重变形，并伴有充血及炎症细胞浸润情况，肝脏大部分面积结构紊乱，给药干预后（D 组）病理改变减轻。见封二彩图8。（2）肝脏切片病理评分显示，A组为轻微炎症，评分为（0.07±0.25）分；B组为无炎症；C 组为轻中度炎症，评分为（2.20±0.75）分；D组为轻微炎症，评分为（1.20±0.40）分。

3 讨论

脓毒血症多是感染或创伤引起的全身系统弥漫性炎症反应[7]，在感染情况下，肝脏构成了宿主防御机制的一道重要屏障，肝细胞在脓毒症时可以迅速地清除机体过量的炎症介质，从而有效地调控机体的炎症反应，在脓毒症发生发展中起重要的作用[3]。川芎嗪是伞形科植物川芎根茎中的主要化学成分之一，为一种新型钙离子拮抗剂。研究证实，川芎嗪具有抑制血小板聚集、降低血小板活性和抑制血管内皮细胞对纤溶酶原激活物抑的分泌及的表达[8]；对机体免疫系统具有重要的调节作用；同时还有扩张肺血管，阻断内皮素受体，减少脂质过氧化物的生成等作用[6]，同时具有活血通脉作用[9]。这些药理作用均可阻断或减轻脓毒症的病理生理过程，有利于脓毒症的防治。

本研究结果表明，川芎嗪能够提高CLP 小鼠7 d 生存率，猜测川芎嗪可能是通过保护肝脏改善抗炎反应和调节免疫的功能，来提高脓毒血症小鼠术后的生存率。本研究结果表明，川芎嗪能够有效保护CLP 小鼠肝功能，保护肝脏炎症损害，调节免疫反应，采用川芎嗪的B组和D 组的ALT、AST、TNF-、IL-1 及IL-6 均显著低于A 组和C 组；病理结果显示，川芎嗪干预下的CLP 小鼠评分明显低于对照组CLP小鼠评分，并且HE染色呈现类似结果，川芎嗪干预下的CLP小鼠肝脏炎性浸润情况优于对照组。这与2009 年陈玉熹等[10]人的研究结果相似。

综上所述，川芎嗪能够通过调节CLP小鼠炎症反应，抑制炎症因子释放，保护肝脏病理生理变化，从而避免脓毒血症进行性加重，提高CLP小鼠术后7d 生存率，改善预后。