结缔组织病伴胆汁淤积患者血清FGF19、Klotho 与肝组织FGFR4 蛋白表达的关系

张振，干敏芝，郑小庆

结缔组织病（CTDs）是一大类由自身免疫介导脏器损伤为特征的疾病总称，其中有一部分CTDs 患者可合并有胆汁淤积性肝病（CLD）。2009 年欧洲肝脏研究学会（EASL）胆汁淤积专家共识建议碱性磷酸酶（ALP）水平高于1.5倍正常值范围上限（ULN），并且谷氨酰转肽酶（GT）水平高于3 倍ULN 可诊断胆汁淤积性肝病（CLD）[1]。成纤维细胞生长因子19（FGF19）可能在胆汁淤积的发生发展中发挥作用。本研究以结缔组织病伴胆汁淤积患者为研究对象，通过测定患者血清FGF19、Klotho 蛋白水平并分析其与胆汁淤积及肝组织成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）表达程度的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年8 月至2020 年1 月中国科学院大学宁波华美医院收治的结缔组织病伴胆汁淤积患者40例（CTDs+CLD 组）。排除标准：妊娠哺乳期妇女、其他严重疾病如肿瘤、肝肾功能不全及血液系统疾病者。另选取结缔组织病不伴胆汁淤积患者 40例（CTDs 组）、同期健康体检者40例为健康对照组（Control 组）。本研究通过本院伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

1.2 方法 详细记录入组患者临床资料，包括性别、年龄、体质量、身高；实验室指标，包括肝功能、抗核抗体（ANA）、抗线粒体抗体（AMA）、透明质酸（HA）及IV 型胶原（IV-C）。

1.2.1 血清FGF19、Klotho 水平检测取清晨空腹静脉血样3 ml，自然凝固后离心收集上清标本储存于－ 80℃冰箱内，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测，严格按照试剂盒说明书进行操作。试剂盒购自上海桥杜生物科技公司。

1.2.2 FGFR4 蛋白检测 采取免疫组化方法，肝组织蜡块经4 m 厚度切片，常规脱蜡和水化，采用3%过氧化氢溶液孵育10 min，经过蒸馏水洗3 次后，再使用PBS漂洗3 次；切片加1 滴第一抗体，4℃冰箱过夜，使用PBS洗3 次，DAB显色后，充分水洗，苏木素复染细胞核，再经水洗、脱水，使用中性树酯封片，显微镜观察。抗人FGFR4 多克隆抗体试剂盒由美国Santa Cruz 公司生产。每张切片由两名病理科医生进行计数，随机选取5 个高倍镜视野，观察阳性细胞染色强度并计数阳性细胞百分率。根据染色强度（0 分：无染色；1 分：淡黄色；2 分：棕黄色；3 分：棕褐色）和阳性细胞百分数（0 分：＜5%；1 分：5%～25%；2 分：26%～50%；3 分：51%～75%；4 分：＞75%）进行评分，两者相乘为最后得分，分为4 个等级：0～2 分为（－），3～5 分为（+），6～8 分为（2+），9～12 分为（3+）。

1.3 统计方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，采用两组独立样本 检验；相关性分析采用Pearson检验；等级资料采用配对样本Wilcoxon 秩和检验；等级资料间相关性分析采用Spearman秩相关分析。＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组一般资料比较 3 组年龄、性别、体质量及身高资料差异均无统计学意义（均＞0.05），具有可比性。CTDs+CLD 组FGF19 水平明显高于CTDs 组、Control组（=6.779、7.075，均＜0.05），Klotho 水平低于CTDs 组、Control 组（=3.081、23.283，均＜0.05）。见表1。

表1 3 组一般资料比较

2.2 CTDs+CLD 组、CTDs 组实验室指标比较 两组ALP、GT、总胆汁酸、AMA抗体阳性率及IV型胶原差异均有统计学意义（均＜0.05），见表2。

表2 CTDs+CLD 组、CTDs 组实验室指标的比较

2.3 结缔组织病患者FGF19 与实验室指标之间的相关性分析 FGF19 水平与ALP、GT、总胆汁酸水平呈正相关，与Klotho 呈负相关（均＜0.05）。见表3。

表3 结缔组织病患者FGF19 与实验室指标之间的相关性

2.4 CTDs+CLD 组FGF19 不同水平间FGFR4的表达 以FGF19 中位浓度（533 pg/ml）为界，将CTDs+CLD患者分为FGF19 高水平组和FGF19 低水平组，两组FGFR4的表达差异有统计学意义（＜0.05）。见表4、封二彩图9。

表4 FGF19 不同水平间FGFR4 表达的配对Wilcoxon 秩和检验 例

2.5 CTDs+CLD 患者FGFR4 水平和FGF19、Klotho 相关行分析 CTDs+CLD患者FGFR4 表达水平与FGF19 水平呈正相关（＜0.05）。见表5。

表5 FGFR4 表达与实验室指标的Spearman 秩相关分析

3 讨论

CTDs 合并CLD 临床并不少见，CLD 症状程度却差异较大，一部分患者因胆汁淤积症状轻微未引起重视，然而持续的胆汁淤积、胆管损伤和肝内炎症可能逐步进展为肝纤维化、肝硬化和终末期肝病。FGF19 是FGF 家族中具有“激素样FGFs”生物学特征的成员之一，其主要在回肠表达，而肝脏是FGF19 作用的主要靶器官[2]。FGF19 在Klotho 蛋白参与协助下与FGFR4 结合[3]，Klotho可使FGF19、FGFR4 之间相互作用的稳定性和亲和力加强，FGF19 激活FGFR4后导致下游信号的活化[4]。肠道中的法呢醇X受体（FXR）发挥胆汁酸感应器的作用，可被胆酸和鹅脱氧胆酸激活，FXR激活后促进FGF19的表达[5]，肠道合成FGF19 增多，通过血流至肝脏[6]，FGF19与FGFR4 结合后诱导小异二聚体伴侣的表达，后者再与肝脏受体同源物1 结合，抑制胆固醇7 1 羟化酶（Cyp7 1）启动子的活性，下调Cyp7 1的表达，Cyp7 1 是胆汁酸合成的关键酶，Cyp7 1 表达降低，胆酸合成减少，肝肠胆汁酸清除增加。FXR 激动剂奥贝胆酸（OCA）作为新型的鹅去氧胆酸衍生物可改善PBC 患者的胆汁淤积[7]。

本研究显示与不伴CLD的CTDs患者比较，CLD组患者FGF19 水平明显升高，Klotho 水平则下降。CLD 组患者具有更高的IV-C 及AMA 抗体阳性率。FGF19 水平与胆汁淤积程度呈正相关、与Klotho 水平呈负相关。血清Klotho蛋白即循环型Klotho，具有抗氧化、抗凋亡等生理作用，炎症反应和氧化应激可下调Klotho的表达，推测CLD 患者中这种低水平的Klotho 可能进一步引起FGF19 水平升高，近年来已开展将Klotho 作为治疗靶点的研究[8]。IV-C 是早期肝脏纤维化的敏感指标，提示对于CLD 患者，需定期监测肝脏纤维化的程度[9]，有体外实验研究显示 FGF19/FGFR4 信号通路具有抗纤维化作用[10]。Wunsch 等[11]发现在原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者中FGF19 水平、FGFR4 表达均增加，认为FGF19 与PBC疾病的严重程度相关，可作为慢性胆汁淤积肝损伤的一个指标。本研究显示CLD 患者中FGF19 高水平组和FGF19 低水平组间FGFR4 表达具有差异性，FGFR4 表达与FGF19 水平正相关，说明FGF19 发挥作用需要FGFR4的协同表达。CLD病例肝脏组织FGFR4 表达免疫组化得分多介于+～2+，无强阳性（3+）的病例。在针对各类肿瘤中FGFR4 表达的研究中，显示在食道癌、肝癌[12]，甲状腺癌[13]中FGFR4 表达显著增高。