复方感冒灵颗粒多指标成分测定方法的建立及综合质量评价

章泽恒，李鹏辉，曾文文，陈开义，吴艳，佘延骄，彭艳梅*（.湖南省药品审评认证与不良反应监测中心，长沙 400；.湖南省中医药研究院，长沙 400；.三金集团湖南三金制药有限责任公司，湖南 常德45000）

复方感冒灵颗粒由山银花、野菊花、三叉苦、五指柑、南板蓝根、岗梅6 味中药和对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏3 种化药制成的中西药复方制剂，具有辛热解表、清热解毒的作用，主要用于治疗感冒发热、头痛、咳嗽等症状。现行药品标准中仅以薄层和滴定法对成品进行质量控制[1]，未对方中所含主要化学成分进行定性定量分析，且滴定法操作步骤相对繁琐，重现性差，难以全面准确地控制该药品质量。

目前针对复方感冒灵颗粒中3 种化药成分含量的分析研究较多，或检测1 种[2]或同时检测3种[3-6]，但由于对乙酰氨基酚含量远远高于咖啡因和马来酸氯苯那敏，同时检测易引起相对误差。本研究通过分析制剂处方中各有效成分[2-7]，着眼于对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏和野菊花的指标性成分蒙花苷，将标示量较高的对乙酰氨基酚和咖啡因、马来酸氯苯那敏分开检测，将中药成分蒙花苷单独检测，建立3 种定量分析方法，并对高效液相色谱法进行方法学验证，通过综合质量评价分析方法，对连续10 批大生产的复方感冒灵颗粒含量检测数据进行统计分析，以考察成品质量的稳定性，该方法可为复方感冒灵颗粒的质量控制提供有益思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent Technologies 1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；XPE-105 电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Quintix224-1CN电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；TD2102 电子天平（余姚市金诺天平仪器有限公司）；HH 恒温水浴锅（江苏金坛市中大仪器厂）；SB-5200D 超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）。

1.2 材料

蒙花苷（批号：111528-201710，含量：96.6%）、对乙酰氨基酚（批号：100018-201610，含量：99.9%）、咖啡因（批号：171215-201512，含量：99.9%）、马来酸氯苯那敏（批号：100047-201507，含量：99.7%）（对照品，中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Sigma 公司）；水为怡宝纯净水；其余试剂均为分析纯。复方感冒灵颗粒（批号为200501 ～200510，规格：14 g/袋，三金集团湖南三金制药有限责任公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 对乙酰氨基酚 色谱柱：Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：水（含0.5%磷酸和0.4%三乙胺溶液）-乙腈（94∶6）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：244 nm；柱温：30℃；进样量：20 µL。理论板数按对乙酰氨基酚峰计算应不低于3000。

2.1.2 咖啡因和马来酸氯苯那敏 色谱柱：Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 µm）； 流动相：水（含0.5%磷酸和0.4%三乙胺溶液）-乙腈（93∶7）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：264 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 µL。理论板数按马来酸氯苯那敏峰计算应不低于4000。

2.1.3 蒙花苷 色谱柱：Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（26∶23∶1）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：334 nm；柱温：30℃；进样量：10 µL。理论板数按蒙花苷峰计算应不低于3000。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 对乙酰氨基酚 精密称取对乙酰氨基酚对照品适量，加水制成103.2966 μg·mL－1的对照品储备液，再稀释得41.3186 μg·mL－1的对照品溶液。精密量取对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置5 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，作为系列对照品溶液。

2.2.2 咖啡因和马来酸氯苯那敏

① 咖啡因：精密称取咖啡因对照品适量，加流动相制成106.4934 µg·mL－1的对照品储备液。分别精密量取咖啡因对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置5 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度作为系列对照品溶液。

② 马来酸氯苯那敏：精密称取马来酸氯苯那敏对照品适量，加流动相制成45.1442 µg·mL－1的对照品储备液。分别精密量取马来酸氯苯那敏对照品储备液1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL置10 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为系列对照品溶液。

另外，精密称取咖啡因、马来酸氯苯那敏对照品适量，加流动相制成质量浓度分别为44.6553、40.1791 µg·mL－1的混合对照品溶液。

2.2.3 蒙花苷 精密称取蒙花苷对照品适量，加甲醇制成135.4332 μg·mL－1的对照品储备液，再稀释得到27.0886 μg·mL－1的对照品溶液。分别精密量取对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为系列对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 对乙酰氨基酚 取本品适量，研细，取约5.0 g，精密称定，置50 mL 量瓶中，加入流动相适量，超声（300 W，40 kHz）处理10 min，取出放冷，加流动相定容至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL 置50 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 咖啡因和马来酸氯苯那敏 取本品适量，研细，取约2 g，精密称定，置50 mL 量瓶中，加入流动相适量，超声（300 W，40 kHz）处理30 min，取出，放冷，加流动相定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 蒙花苷 取本品适量，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声（300 W，40 kHz）处理30 min，取出放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

按复方感冒灵颗粒处方和制备工艺分别制备缺对乙酰氨基酚、缺咖啡因和马来酸氯苯那敏、缺野菊花的阴性样品，并分别按“2.3”项下方法制成3 种阴性样品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性 分别取对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏、蒙花苷的对照品溶液，供试品溶液，阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见图1，表明3 种测定方法下阴性样品均无干扰。

图1 复方感冒颗粒专属性考察结果Fig 1 Specificity inspection of compound Ganmaoling granule

2.5.2 线性范围 精密吸取“2.2”项下4 种线性溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录各峰面积。以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程，结果见表1。

表1 4 种指标成分的线性范围考察结果Tab 1 Linearity of 4 index components

2.5.3 精密度 取复方感冒灵颗粒供试品适量，按“2.3”项下方法制备3 种供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6 次，记录各峰面积，计算得到对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏、蒙花苷峰面积RSD分别为0.71%、0.38%、0.81%、0.76%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性 按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液6 份并测定。结果对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏、蒙花苷含量平均值分别为10.76、0.85、0.19、0.52 mg·g－1，RSD分别为1.8%、1.1%、3.5%、0.42%，表明方法重复性良好。

2.5.5 中间精密度 按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液6 份并测定，考察不同设备、不同日期、不同分析人员条件下的中间精密度。结果12 份供试品的对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏、蒙花苷含量平均值分别为10.74、0.85、0.18、0.53 mg·g－1，RSD分别为0.23%、0.72%、6.8%、2.0%，表明方法中间精密度良好。

2.5.6 稳定性 取“2.5.3”项下各供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h 进行测定，记录各峰面积。结果对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏、蒙花苷峰面积RSD分别为0.32%、0.45%、0.85%、0.20%，说明供试品溶液在8 h 内稳定性良好。

2.5.7 加样回收试验

① 对乙酰氨基酚：取同一批号已知含量的复方感冒灵颗粒9 份，按样品中已知含量的50%、100%、150%加入对照品适量，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液（取样量减半），进样测定。

② 咖啡因、马来酸氯苯那敏、蒙花苷：分别配制质量浓度为1283.715、285.5408、474.4992µg·mL－1的咖啡因、马来酸氯苯那敏、蒙花苷对照品溶液。取同一批号已知含量的复方感冒灵颗粒9 份，按样品中已知含量的50%、100%、150%加入对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备各供试品溶液（取样量减半），进样测定。

结果对乙酰氨基酚低、中、高浓度的平均加样回收率分别为100.67%（RSD＝0.85%）、98.02%（RSD＝1.6%）、97.08%（RSD＝0.63%）；咖啡因低、中、高浓度的平均加样回收率分别为104.37%（RSD＝0.71%）、104.03%（RSD＝0.81%）、104.25%（RSD＝0.80%）；马来酸氯苯那敏低、中、高浓度的平均加样回收率分别为100.92%（RSD＝3.2%）、102.61%（RSD＝1.9%）、102.16%（RSD＝0.50%）；蒙花苷低、中、高浓度的平均加样回收率分别为102.01%（RSD＝3.8%）、100.14%（RSD＝1.8%）、97.30%（RSD＝0.96%）。

2.6 样品含量测定结果

取10 批复方感冒灵颗粒，制备供试品溶液，进样测定，记录各峰面积，计算样品中对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏、蒙花苷的含量，结果见表2。

表2 10 批复方感冒灵颗粒的含量测定结果(mg·g－1，n ＝2)Tab 2 Content determination of 10 batches of compound Ganmaoling granules (mg·g－1，n ＝2)

复方感冒灵颗粒规格为14 g/袋，其中对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏的标示量分别为168 mg、11.998 mg、2.674 mg。从表2的结果可知，实测每袋含对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏的均值为170.57 mg、12.38 mg、2.58 mg，分别为标示量的101.53%、103.21%、96.48%。符合标准中对乙酰氨基酚、咖啡因应为标示量的85%～115%、马来酸氯苯那敏应为标示量的80%～120%的要求。标准中规定每袋含蒙花苷不得少于3.96 mg，从表2的10 批含量测定结果可知，实测每袋蒙花苷含量在7.07 ～8.46 mg，均符合要求。

2.7 综合质量评价分析

采用SPSS 18.0 软件，将对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏和蒙花苷含量测定结果进行主成分分析[8-9]，提取特征值≥1 的前两个主成分，方差的累积贡献率达到73.547%，说明能代表原始数据大部分的信息。主成分的主要信息见表3，X1～X4分别代表对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏、蒙花苷的含量。

表3 主成分的特征值、方差累积贡献率和特征向量值Tab 3 Eigenvalue，variance accumulated contribution rate，and eigenvector of principal component analysis

根据特征向量，得到两个主成分的线性组合表达式为：

Z1＝－0.812X1＋0.853X2－0.033X3＋0.636X4

Z2＝－0.423X1－0.109X2＋0.978X3－0.054X4

再以每个主成分的贡献率作为权数，构建综合评价函数：

f＝0.460 32Z1＋0.275 15Z2

将每个样品的主成分得分计算出后，代入综合评价函数，计算f值。10 批复方感冒灵颗粒f值分别为－5.32、－5.34、－5.32、－5.36、－5.26、－5.30、－5.39、－5.69、－5.76、－5.74，均值为－5.45，RSD为3.7%。综合质量评价函数结果表明10 批大生产复方感冒灵颗粒质量稳定可控。

3 讨论

3.1 流速的选择

分别在0.9、1.0、1.1 mL·min－1（柱温均为30 ℃）流速下进行耐用性考察，结果表明流速对3 种含量测定方法均无明显影响，因此流速均选择液相的普适条件1.0 mL·min－1。

3.2 柱温的选择

分别在25、30、35℃（流速均为1.0 mL·min－1）柱温下进行耐用性考察，结果表明柱温对蒙花苷、对乙酰氨基酚含量测定无明显影响，而在35℃时，马来酸氯苯那敏与杂质峰分不开，因此柱温选择液相的普适条件30℃。

3.3 小结

本研究建立了复方感冒灵颗粒中对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏和蒙花苷4 种指标成分含量测定方法，方法学考察表明专属性、重现性、稳定性等均较好，以这4 种指标成分检测数据作为评价依据，采用客观赋权评价法进行综合质量评价分析，根据指标之间的相关关系和各项指标的变异系数来确定权重，避免人为的主观因素干扰，能更加客观地评价复方感冒灵颗粒的整体质量[10-11]。