通痹胶囊通过NF-κB信号通路缓解弗氏完全佐剂所致大鼠炎性痛的作用机制

2021-09-04张倩闫国强张俊艳金颖慧丁洪青尹忠英董晶晶李宝芬郭煊河北省沧州中西医结合医院河北沧州06000沧县医院河北沧州06000

中南药学 2021年8期

张倩，闫国强，张俊艳，金颖慧，丁洪青，尹忠英，董晶晶，李宝芬，郭煊（.河北省沧州中西医结合医院，河北沧州 06000；.沧县医院，河北沧州 06000）

炎性痛是临床疼痛症状中最重要的类型[1]，它是指生物源或化学源性炎症刺激神经系统所致的疼痛，组织损伤、伤害性刺激等均可导致炎性痛的发生，其在临床上一般表现为炎性因子的释放，局部组织红、肿、热、痛和功能障碍等，并伴有自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏等[2-3]。而严重的疼痛或是长期的慢性疼痛，会极大地影响患者的生活质量，造成患者睡眠障碍、情绪低落甚至抑郁等。由于炎性痛发病机制的复杂性，行之有效的治疗手段仍然十分缺乏。与使用广泛的非甾体抗炎药、选择性COX-2 抑制剂等镇痛药物相比，中药复方具有不良反应少、疗效持久、患者依从性好等诸多优势，在临床上发挥了不可替代的治疗效果。通痹胶囊由秦艽、香附、羌活等15 味中药组成，能够祛风湿、通经络、止痹痛，临床上用于类风湿关节炎的治疗[4]，其对类风湿关节炎患者的疼痛症状具有明显的改善作用，为进一步阐释通痹胶囊的抗炎镇痛作用，本文拟通过对弗氏完全佐剂诱导的疼痛模型大鼠机械缩足反射阈值及热缩足反射阈值的测定，观察通痹胶囊的止痛效果；通过对炎性因子及相关蛋白的测定，初步探讨通痹胶囊抗炎镇痛的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级Wistar 雌性大鼠48 只（河北医科大学实验动物中心），许可证号：SCXK（冀）2013-1-003，体质量（200±20）g，在湿度50%～60%、（24±2）℃的环境中自由摄食、饮水。

1.2 试药

通痹胶囊（河北省沧州中西医结合医院，批号：180508，规格：0.3 g/粒）；雷公藤多苷片（远大医药黄石飞云制药有限公司，批号：20170102，规格：10 mg/片）；注射用弗氏完全佐剂（美国Sigma 公司）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（深圳达科为生物技术有限公司）；BCA 蛋白定量试剂盒（北京方程生物科技有限公司）；兔抗鼠NF-κB/P65、NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）、IκB 激酶β（IKKβ）多克隆抗体（美国Proteintech Group 公司）；山羊抗兔二抗（美国Biofine 公司）；兔抗鼠β-actin 抗体（美国 Immunoway 公司）。

1.3 仪器

电动组织匀浆器（美国Fluka 公司）；SZ61TRC-1LST 型解剖镜（日本fineOlympus 公司）；电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；Von Frey 测痛仪（美国Stoelting 公司）；PE34 冷热盘测痛仪（美国IITC 公司）；MultiSkan3 全自动酶标分析仪（美国Thermo 公司）。

2 方法

2.1 动物模型的制备[5]

大鼠适应性喂养1 周后，在右后肢足底中部皮下注射100 μL 的弗氏完全佐剂制备炎性痛模型。

2.2 分组与给药

正常组8 只，40 只炎性痛模型大鼠随机分为5 组，即模型组，通痹胶囊低、中、高剂量组与雷公藤多苷片组，造模后第8日开始按通痹胶囊低剂量组[375 mg/（kg·d）]、中剂量组[750 mg/（kg·d）]、高剂量组[1500 mg/（kg·d）]（分别相当于临床成人剂量的2、4、8 倍），雷公藤多苷片组[10 mg/（kg·d）]进行灌胃治疗4 周，每日1 次。正常组、模型组给予相同体积生理盐水。

2.3 检测指标与方法

2.3.1 体质量及爪水肿分别于造模前1日和造模后第7日、14日、21日、28日和35日测量大鼠的体质量，采用游标卡尺测大鼠注射足的掌心和爪后跟的厚度，游标卡尺读数精确到0.02 mm。

2.3.2 机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的测定造模后第7日、14日、21日、28日和35日，将环境温度维持在20 ～25℃、湿度46%～52%，大鼠适应环境15 min 后，将其置于金属网格笼中（20 cm×20 cm×20 cm），采用Von Frey 纤维毛刺激大鼠右后肢足底中部，记录出现缩足反应时的读数，并参照陈志新等[6]的方法计算50%MWT。

2.3.3 热缩足反射阈值（thermal withdrawal latency，TWT）的测定造模后第7日、14日、21日、28日和35日，完成MWT 的测定后，启动足底热痛仪并将温度调至55℃，待稳定后，将大鼠放入仪器内，记录大鼠出现缩足、舔足等反应的时间。为防止烫伤大鼠，测定时间上限为30 s，每只大鼠测定3 次，每次间隔10 min，取平均值。

2.3.4 大鼠脊髓组织中TNF-α、IL-1、IL-6 的表达大鼠以水合氯醛400 mg·kg－1腹腔注射麻醉后处死。快速取出脊髓L4～L5段，混悬于PBS 中，于4 ℃1000 r·min－1离心15 min，ELISA 试剂盒检测炎症疼痛大鼠脊髓背角组织中TNF-α、IL-1 和IL-6 等细胞因子的表达。

2.3.5 大鼠脊髓组织中NF-κB/P65、IκBα、IKKβ蛋白的表达大鼠末次给药后完成行为学检测后颈椎脱臼处死，快速取出大鼠L4～L6脊髓组织，用RIPA 蛋白抽提试剂进行组织蛋白提取，匀浆器匀浆后于4 ℃1000 r·min－1离心15 min，取上清液即为提取的总蛋白，用BCA 法检测各样本总蛋白浓度，并调整一致。沸水中灭活蛋白5 min，行SDS-PAGE，转膜，加NF-κB/P65、IκBα、IKKβ一抗，室温孵育10 min，4 ℃过夜，TBST 洗模3 min×5 次。加HRP 标记的二抗（均为1∶10 000），室温封闭2 h，TBST 洗模3 min×6 次。ECL 发光试剂盒显色，凝胶成像仪下拍照，分析蛋白表达情况。

2.4 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据处理和分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组间用单因素方差分析，组间样本均数比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对体质量及爪水肿的影响

造模前、后及给药后各组大鼠体质量均无明显差异，见表1。各组大鼠在造模前，足后跟及掌心厚度无明显差异；造模后，模型组大鼠注射足后跟及掌心厚度明显增加，与正常组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；经给药治疗28 d 后，通痹胶囊组及雷公藤多苷片组均能显著降低注射足后跟及掌心厚度（P＜0.05 或P＜0.01），见表2、3。

表1 通痹胶囊对炎性痛大鼠体质量的影响(± s，n ＝8)Tab 1 Effect of Tongbi capsule on the body mass of inflammation pain rats (± s，n ＝8)

组别剂量/[mg/（kg·d）]造模前/g造模后/g给药后/g 14 d21 d28 d35 d正常组/198.50±9.89217.38±11.64240.63±9.52268.38±9.41291.75±10.31331.88±11.32模型组/199.50±11.19216.88±10.27242.00±15.73261.38±17.20286.13±15.68319.25±23.86通痹胶囊组 375204.50±12.68222.00±12.64246.13±12.28271.00±11.72293.75±11.31330.63±13.31 750203.13±12.21218.25±13.58243.13±12.64264.63±11.61287.75±12.19329.38±12.76 1500208.25±11.32224.75±8.48249.50±12.96272.63±11.89294.63±13.44327.63±16.55雷公藤多苷片组 10199.50±11.64221.13±6.81236.38±13.17264.75±13.71298.38±17.17326.63±17.74

表2 通痹胶囊对炎性痛大鼠注射足后跟厚度的影响(± s，n ＝8)Tab 2 Effect of Tongbi capsule on injection heel thickness in inflammatory pain rats (± s，n ＝8)

注：与正常组比较，▲▲P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01Note：vs the nomal group，▲▲P ＜0.01；vs the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

[mg/（kg·d）]造模前/mm造模后/mm给药后/mm 14 d21 d28 d35 d正常组/4.77±0.144.79±0.144.78±0.154.77±0.144.75±0.154.76±0.15模型组/4.73±0.146.23±0.49▲▲6.21±0.496.23±0.456.14±0.366.08±0.34通痹胶囊组 3754.82±0.166.25±0.21▲▲6.05±0.275.72±0.21*5.41±0.23**5.35±0.19**组别剂量/7504.81±0.226.26±0.27▲▲6.02±0.225.70±0.29*5.38±0.30**5.20±0.27**15004.86±0.136.34±0.29▲▲5.72±0.36*5.25±0.17**5.03±0.22**4.97±0.21**雷公藤多苷片组 104.76±0.156.17±0.27▲▲6.01±0.275.47±0.13**5.15±0.09**5.08±0.14**

表3 通痹胶囊对炎性痛大鼠注射足掌心厚度的影响(± s，n ＝8)Tab 3 Effect of Tongbi capsule on injection palm thickness in inflammatory pain rats (± s，n ＝8)

注：与正常组比较，▲▲P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。Note：vs the nomal group，▲▲P ＜0.01；vs the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

组别剂量/[mg/（kg·d）]造模前/mm造模后/mm给药后/mm 14 d21 d28 d35 d正常组/3.27±0.133.26±0.133.27±0.123.26±0.113.25±0.113.24±0.10模型组/3.22±0.137.80±0.23▲▲7.97±0.197.91±0.197.88±0.177.83±0.16通痹胶囊组 3753.31±0.167.99±0.32▲▲7.83±0.327.68±0.317.55±0.29*7.59±0.22*7503.34±0.177.86±0.38▲▲7.59±0.41*7.40±0.37**7.18±0.34**6.84±0.38**15003.28±0.087.97±0.22▲▲7.63±0.23**7.07±0.18**6.81±0.16**6.52±0.13**雷公藤多苷片组 103.19±0.058.05±0.29▲▲7.93±0.287.61±0.31*7.31±0.26**7.10±0.29**

3.2 对MWT 的影响

与正常组相比，造模后第7日，模型组、通痹胶囊各剂量组及雷公藤多苷片组MWT 明显缩短（P＜0.01）；与模型组相比，造模后第14日，中、高剂量通痹胶囊组MWT 相对提高（P＜0.05，P＜0.01），造模后第21日、28日及35日，通痹胶囊各剂量组及雷公藤多苷片组MWT 均明显提高（P＜0.01），见图1。

图1 通痹胶囊对炎性痛大鼠机械缩足反射阈值的影响Fig 1 Effect of Tongbi capsule on MWT in inflammatory pain rats

3.3 对TWL 的影响

与正常组相比，造模后第7日，模型组、通痹胶囊各剂量组及雷公藤多苷片组TWL 明显缩短（P＜0.01）；与模型组相比，造模后第14日、21日、28日及35日，通痹胶囊各剂量组及雷公藤多苷片组TWL 均明显提高（P＜0.01），见图2。

图2 通痹胶囊对炎性痛大鼠热缩足反射阈值的影响Fig 2 Effect of Tongbi capsule on TWL in inflammatory pain rats

3.4 ELISA 法检测大鼠脊髓组织中TNF-α、IL-1、IL-6 的表达水平

由表4可知，模型组大鼠脊髓组织中TNF-α、IL-1、IL-6 的含量较正常组明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，通痹胶囊低剂量组能够降低大鼠脊髓组织中IL-6 的含量（P＜0.05）、中剂量组可降低TNF-α和IL-6 的含量（P＜0.01）、高剂量组及雷公藤多苷片组均可显著降低大鼠脊髓组织中TNF-α、IL-1 和IL-6 的含量（P＜0.01）。

表4 通痹胶囊对炎性痛大鼠脊髓组织中TNF-α、IL-1、IL-6 含量的影响(± s，n ＝8)Tab 4 Effect of Tongbi capsule on the levels of TNF-α，IL-1，and IL-6 in the spinal tissue (± s，n ＝8)

注：与正常组比较，▲▲P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。Note：vs the nomal group，▲▲P ＜0.01；vs the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

－1－1－1组别剂量/[mg/（kg·d）]TNF-α/（pg·mL）IL-1/（pg·mL）IL-6/（pg·mL）正常组/50.96±2/108.13±4 375109.99±6 750 88.74±7 1500 78.88±2.1236.24±5.3843.46±3.57模型组.04▲▲87.80±6.10▲▲97.94±4.47▲▲通痹胶囊组.4386.61±7.1191.61±4.05*.43**86.30±6.8580.67±2.80**.47**67.08±3.39**68.23±3.83**雷公藤多苷片组 10 72.97±4.84**68.51±5.01**82.81±3.43**

3.5 对大鼠脊髓组织中NF-κB/P65、IκBα、IKKβ蛋白表达的影响

由图3可知，模型组大鼠脊髓组织中NFκB/P65、IκBα、IKKβ蛋白表达明显高于正常组（P＜0.01）；与模型组相比，通痹胶囊各剂量组及雷公藤多苷片组治疗后均能明显抑制NF-κB/P65 及IκBα的蛋白表达（P＜0.05 或P＜0.01），通痹胶囊中、高剂量组及雷公藤多苷片组均能明显抑制IKKβ的蛋白表达（P＜0.01）。

图3 通痹胶囊对炎性痛大鼠脊髓组织中NF-κB/P65、IκBα、IKKβ蛋白表达的影响Fig 3 Effect of Tongbi capsule on the protein expression of NF-κB/P65，IκBα and IKKβ in the spinal cord tissue in inflammatory pain rats A.正常组（the nomal group）；B.模型组（the model group）；C.通痹胶囊低剂量组（the low-dose group of Tongbi capsule）；D.通痹胶囊中剂量组（the medium-dose group of Tongbi capsule）；E.通痹胶囊高剂量组（the high-dose group of Tongbi capsule）；F.雷公藤多苷片组（the tripterygium glycosides table group）

4 讨论

目前，可用于建立炎性痛模型的方式有很多种，有用于急性或亚急性炎症模型建立的福尔马林模型和角叉菜胶模型，用于慢性炎性痛模型建立的弗氏佐剂模型、蜂蜜毒模型以及松节油模型等[7]，其中弗氏佐剂炎性痛模型是目前最常用的经典炎性痛模型[8]。该模型通过在大鼠或小鼠的足底皮下注射弗氏佐剂，使注射部位发生炎症反应，并伴随较长时间的痛觉过敏，从而模拟人持续性或慢性炎性疼痛。本文在大鼠足底皮下注射弗氏完全佐剂后，模型大鼠患足出现红肿现象，并有脓液产生，注射足后跟和掌心厚度明显增加，MWT 和TWT 均显著降低。给药治疗后，通痹胶囊能够明显改善注射足肿胀现象，提高炎性痛大鼠MWT、延长其TWT 潜伏期，提示通痹胶囊对弗氏完全佐剂诱导的慢性炎性痛具有较好的缓解作用。

类风湿关节炎等炎性痛类疾病往往与组织损伤所导致的炎症反应有关[9-10]，因此，控制炎症的发展是减轻炎性疼痛症状的有效措施之一[11-13]。当机体受到损伤发生炎症时，炎症组织释放或合成炎性介质，激活受体，使痛觉感受器兴奋而产生痛觉。NF-κB 作为转录因子，在真核细胞中起到调节核转录的作用，如细胞因子、免疫受体、黏附因子等基因的表达均受NF-κB 的调节，不仅如此，NF-κB 还在炎症、细胞增殖与分化等多种生理和病理过程中发挥重要作用，是炎症反应的关键信号通路[14]。

激活的NF-κB 通路能够促进炎性痛的形成[14-16]，在正常的生理状态下，NF-κB 与其抑制蛋白IκB 结合在一起，核定位序列被覆盖，从而无法以活性的形式存在于胞浆中。一旦细胞受损或在炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6 等刺激下，IκB 的氨基末端高度保守的丝氨酸残基被IκB 激酶（IKK）激活后，发生磷酸化，并被快速降解，使得NF-κB 从结合状态变为游离状态，激活后进入细胞核，与DNA 特定位点结合调节基因的转录[17]。NF-κB 通路的激活，可以诱导TNF-α、IL-1、IL-6 等细胞因子的生成，而这些炎性因子又同时是NF-κB 的活化剂，可进一步激活NF-κB的活性，促使炎症反应进一步扩大，导致疼痛的不断加重[18-19]。IKKβ/IκBα/NF-κB 信号转导途径是调控炎性痛发生发展的重要通路，抑制其活性，可有效缓解炎性痛症状。

本研究结果显示，通痹胶囊能够显著降低炎性痛大鼠脊髓组织中炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6 的含量，抑制IKKβ、IκBα及NF-κB 的蛋白表达，其缓解弗氏完全佐剂所致炎性痛的作用机制可能为抑制NF-κB 信号通路的激活。