脑心通通过抑制TRPM7抗神经元氧糖剥夺/复氧损伤

马妍，吴丹，张伟，梁嘉钰，李斌（.天津中医药大学第二附属医院，天津 30050；.天津中医药大学，天津 3067）

目前，中风已成为成人致残的首要原因，是仅次于冠心病的全球第二大致死原因，其中缺血性卒中约占80%[1]。中医药对缺血性中风的治疗效果肯定[2]，脑心通胶囊作为上市多年的中成药，由黄芪、赤芍、丹参、当归、川芎、桃仁、红花、乳香（制）、没药（制）、鸡血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龙、全蝎、水蛭等16 味药组成，其可益气活血、化瘀通络，用于气虚血瘀、脉络瘀阻所致中风、冠心病等。脑心通具有抑制炎症因子释放、抗氧化及凋亡、神经保护等作用[3]，关于脑心通胶囊治疗中风方面研究目前集中在临床和动物方面，其体外及深入机制研究较少。

脑缺血后神经损伤的机制，除神经元缺血缺氧后Na＋-K＋-ATP 酶活性降低，细胞去极化，释放兴奋性氨基酸，引发兴奋性氨基酸受体介导的Na＋和Ca2＋内流外，非谷氨酸机制在脑缺血后离子失衡及细胞死亡中也起到了相当重要的作用[4]，如瞬时受体电位通道（TRP）[5-6]、酸敏感离子通道（ASICs）[7]等。其中TRPM 是一种非特异性阳离子通道，其成员TRPM2 和TRPM7 在脑缺血过程中与Ca2＋失衡导致的细胞损伤甚至细胞死亡关系密切[8]。随着缺氧时间延长，谷氨酸释放造成的Ca2＋浓度升高不再是主要原因，而TRPM7 成为Ca2＋内流的主要通道，其开放与一氧化氮（NO）介导的活性氧（ROS）大量生成有关[9]。

基于以上研究现状，本研究以原代培养大脑皮层神经元为研究对象，建立氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）损伤模型，由于中药复方用于离体实验存在诸多问题，本研究采用脑脊液药理学的给药方法，观察脑心通的神经保护作用以及对TRPM7的影响，以期为脑心通治疗缺血性脑卒中提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

Wistar 大鼠，体质量（180±20）g [天津中医药大学实验动物中心，SCXK（津）2009-0004]；大耳白家兔，体质量（2±0.2）kg [天津市工程所实验动物中心，SCXK（津）2010-0002]。

1.2 试药

DMEM/F12 培养基、DMEM 无糖培养基、B-27、胰酶（不含EDTA）、D-hank’s 溶液（美国Gibco）；胎牛血清、青霉素/链霉素、PBS 溶液（美国Hyclone）；DAPI 溶液（即用型）、多聚赖氨酸（索来宝）；微管相关蛋白2（MAP2）-抗（兔源）、Anti-rabbit IgG（H ＋L）、F（ab）2Fragment（Alexa Fluor.488Conjugate）（美国CST）；Triton X-100、DSMO（美国Sigma）；CCK-8 检测试剂盒（日本同仁化学研究所）；LDH 检测试剂盒（南京建成公司）；Trizol（美国Invitrogen）；反转录第一链cDNA 合成试剂盒、FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（瑞士Roche）；脑心通胶囊超微粉（陕西步长集团，用超纯水配制成质量浓度为0.262 g·mL－1的溶液备用）。TRPM7 的PCR引物委托上海生工生物技术有限公司设计合成，引物序列（Forward primer：5’-CAGAGCACGATGTCCTGAGA-3’；Reverse primer：5’-GCAAATGTGAGCTTCTGTGC-3’）。

2 方法

2.1 神经元原代培养

将怀孕16 ～17 d 的Wistar 孕鼠脱臼处死，无菌条件下剪开腹腔分离串珠状子宫，取出胎鼠、分离胚胎大脑，剔除软脑膜及大血管，得到胚胎大脑皮层。将其剪成约1 mm×1 mm×1 mm的组织块，加入0.25%的胰蛋白酶37 ℃消化、温和吹打、过滤，滤液800 r·min－1离心，弃上清，将细胞用含10% FBS 的DMEM/F12 培养基重悬，调整细胞密度为1×106·mL－1，接种于预先包被0.01%多聚赖氨酸的培养板中。接种4 h 后置换为无血清DMEM/F12 完全培养基（含2% B-27，0.5%双抗）。隔一日半量换液一次。7 d 后用于实验。

2.2 原代神经元鉴定[MAP2 免疫荧光染色]

将原代培养的胎鼠大脑皮层神经元（cortical neuron cell，CNC）以1×106·mL－1密度接种于24 孔板中7 d，每孔加入 4%的多聚甲醛固定、晾干后置于－20℃冰箱备用。实验时每孔加入0.5% Triton-100 15 min 后加入以1∶50 比例稀释的MAP2 一抗（兔源）。4 ℃冰箱中12 h 过夜。加入1∶1000 比例稀释的荧光二抗（抗兔），37℃避光孵育后加入DAPI 工作液，室温避光孵育10 min 后，置于荧光倒置显微镜下观察拍片。

2.3 脑心通含药脑脊液（BNC）的制备

将大耳白家兔随机分为脑心通组及空白组，按照人与家兔剂量换算后的给药剂量[0.262 g/（kg·d）]，予脑心通组家兔以脑心通胶囊超微粉水溶液灌胃，每日一次，连续3 d。空白组不予特殊处理。于脑心通组最后一次灌胃2 h 后采集两组家兔脑脊液：将家兔耳缘静脉注射空气处死，取侧卧位置于手术台，充分暴露出枕骨大孔。清除毛发，暴露颈部皮肤，酒精消毒后剪开皮肤，钝性分离肌肉组织，将1 mL 注射器适量地抽取负压，于枕骨粗隆下约1 cm 处进针，向家兔鼻尖的方向缓慢刺入。当见到无色透明的液体流入注射器时固定针头，缓慢抽取脑脊液。将抽取的脑脊液汇集注入离心管内，3000 r·min－1离心15 min，过滤除菌，分装，置于－80℃冰箱内冻存备用。

2.4 分组及处理

CNC 以1×106个·mL－1密度接种于96 孔板，将其随机分为正常组、空白脑脊液组、不同剂量脑心通含药脑脊液组。

实验前正常组置换为DMEM/F12 培养基；空白脑脊液组置换为含20%空白脑脊液的DMEM/F12 培养基；脑心通含药脑脊液各组置换为含有不同剂量脑心通脑脊液的DMEM/F12 培养基，根据参考文献[10-11]分别设置剂量梯度为2.5%、5%、10%、15%、20%；为排除空白脑脊液的影响，用空白脑脊液将脑心通含药脑脊液各组补足至每组脑脊液总百分比均为20%（即2.5%脑心通含药脑脊液组培养基中含有17.5%空白脑脊液、5%脑心通含药脑脊液组培养基中含15%空白脑脊液，以此类推），各组均培养6 h。

RT-PCR 实验中取以1×106个·mL－1密度接种于6 孔板的CNC，分为正常组、模型组、不同剂量脑心通含药脑脊液组。正常组及模型组培养基中均含有20%空白脑脊液以排除干扰，不同剂量脑心通含药脑脊液各组均以空白脑脊液补足。

2.5 神经元OGD/R 模型的建立

CNC 以1×106个·mL－1密度接种，以氧糖剥夺12 h/复氧4 h、氧糖剥夺9 h/复氧3 h、氧糖剥夺6 h/复氧2 h、氧糖剥夺4 h/复氧2 h 四种不同氧糖剥夺/复氧时间进行实验，另设正常组，每组设8 个平行孔。正常组：开始实验后将培养基置换为加葡萄糖（4500 mg·L－1）的无糖DMEM 培基，按照不同OGD/R 总时长分别继续培养16、12、8、6 h；OGD/R 组：开始实验后将培养基置换为用1 mmol·L－1HCl 调节成pH 值为6.4 ～6.8 的无糖DMEM 酸性培基，将培养板放入缺氧小室中进行不同时长的缺氧。氧糖剥夺结束后取出培养板，将培养基置换为加葡萄糖的无糖DMEM 培基，于CO2培养箱以不同时长复氧孵育。

2.6 CCK-8 法检测CNC 细胞活力

每孔加入CCK-8 与DMEM/F12 混合液（比例为1∶10）100 μL，避光孵育2 h，于酶标仪450 nm 波长处测定吸光度值。

2.7 LDH 试剂盒检测CNC 细胞膜损伤情况

留取氧糖剥夺和复氧后的细胞培养液混合，按照LDH 试剂盒说明书操作。每孔依次加入氧化型辅酶I、2，4-二硝基苯肼、0.4 mol·mL－1NaOH 溶液等试剂，于酶标仪450 nm 波长处测定吸光度值。

2.8 RT-PCR 法检测TRPM7 mRNA 的表达水平

将CNC 按“2.3”“2.4”项下方法处理后加入Trizol，反复吹打至细胞全部脱落、破裂，提取细胞总RNA，用紫外分光光度法检测RNA 样品的浓度及纯度，后按照试剂盒说明书，反转录合成cDNA，制备反应体系，应用实时定量PCR 仪分析，进行扩增反应、数据分析。

2.9 统计学处理

实验数据以均数±标准差（±s）表示，用SPSS 17.0 进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析方法，P＜0.05 认为差异有统计学意义。方差不齐时用Tamhanes’s h2 统计方法。

3 结果

3.1 CNC 形态结构观察

倒置相差显微镜下观察CNC 的形态，接种后4 h 初贴壁时，已有部分CNC 长出细小突触；1 d 后，CNC 立体感增强，周边有光晕，大部分CNC 长出突起；3 d 时，CNC 胞体增大，以多级CNC 为主，连结成稀疏的网络；5 d 时，CNC 胞体明显增大，突起增粗、增长，交结成网；7 d 时，CNC 有明显立体感，分支连接成网，胞体增大，部分聚集成团（见图1）。当CNC 受到OGD/R 损伤后，胞体皱缩，胞浆呈空泡状，轮廓模糊，突起损伤，出现溶解现象（见图2A）。

图1 神经元培养不同时间的生长情况（200×）Fig 1 Growth of CNC cultured for different time（200×）

3.2 MAP2 免疫荧光染色鉴定神经元

MAP2 是组成神经元细胞骨架的重要组成成分，是神经元轴突的标志物，MAP2 免疫荧光染色后，可见90%以上细胞胞浆呈阳性（见图2B）。结果表明该实验方法获得的细胞为神经元，纯度符合实验要求。

图2 神经元缺氧9 h/复氧3 h 损伤后的情况（A）及神经元MAP2免疫荧光染色（B）（200×）Fig 2 CNC injured after 9 h hypoxia and 3 h reoxygenation（A），and the immunofluorescence staining of MAP2 of CNC（B）（200×）

3.3 脑心通含药脑脊液对正常培养神经元细胞活力、LDH 释放量的影响

10%脑心通含药脑脊液可显著提高正常培养CNC 的细胞活力（P＜0.05），其他各组有提高CNC 细胞活力的趋势（见图3A）；各剂量脑心通含药脑脊液对CNC 的LDH 释放量无明显影响（见图3B）。以上说明脑心通含药脑脊液对正常培养的CNC 无明显损伤作用，10%脑心通含药脑脊液可提高正常培养CNC 的细胞活力。

图3 脑心通含药脑脊液对正常培养CNC 细胞活力（A）及LDH 含量（B）的影响Fig 3 Effect of BNC on cell activity（A）and content of LDH（B）of normal cultured CNC

3.4 神经元OGD/R 模型的建立

如图4所示，OGD/R 各实验组CNC 的细胞活力均明显降低（P＜0.01），其中氧糖剥夺时间是决定细胞损伤程度的关键。根据OGD/R 后CNC 损伤程度，确定OGD/R 模型条件为氧糖剥夺4 h/复氧2 h。

图4 不同氧糖剥夺、复氧时间对CNC 细胞活力的影响Fig 4 Effect of different oxygen-glucose deprivation and reoxygenation time on the viability of CNC cells

3.5 脑心通含药脑脊液对神经元OGD/R 损伤后细胞活力、LDH 释放量的影响

与正常组相比，OGD/R 组CNC 细胞活力明显下降（P＜0.01）（见图5A），LDH 释放量明显增加（P＜0.01）（见图5B）；各剂量脑心通含药脑脊液均可明显提高神经元OGD/R 损伤后的细胞活力（P＜0.01）（见图5A），5%～20%脑心通含药脑脊液可明显降低神经元OGD/R 损伤后LDH 的释放量（P＜0.05，P＜0.01）（见图5B）。可见脑心通含药脑脊液具有抗神经元OGD/R 损伤的作用。

图5 不同剂量脑心通含药脑脊液对神经元OGD/R 损伤后细胞活力（A）及LDH 释放量（B）的影响Fig 5 Effect of different doses of BNC on cell viability（A）and LDH release（B）of CNC after OGD/R injury

3.6 脑心通含药脑脊液对神经元OGD/R 损伤后TRPM7 mRNA 表达的影响

综合以上实验结果，确定了神经元OGD/R 模型条件为氧糖剥夺4 h/复氧2 h，选取本实验的脑心通含药脑脊液给药低、中、高剂量（分别为2.5%、5%和10%）。如图6所示，神经元OGD/R 损伤后，OGD/R 组神经元内TRPM7 mRNA 的表达水平较对照组明显升高（P＜0.01）；脑心通含药脑脊液各组均可明显降低神经元OGD/R 损伤后TRPM7 的mRNA 的表达水平（P＜0.05，P＜0.01）。

图6 脑心通含药脑脊液对神经元OGD/R 损伤后TRPM7 mRNA 表达的影响Fig 6 Effect of BNC on TRPM7 mRNA expression after OGD/R injury in CNC

4 讨论

原代培养神经元在体外实验中具有优势[12]。OGD/R 模型是较接近体内情况的一种实验模型[13-14]，可更好地模拟脑缺血再灌注的体内变化情况。脑脊液药理学方法具有避免血清对神经元的毒害作用、解决药物通过血脑屏障问题等优势[15-17]。

脑缺血可导致ATP 生成减少、离子泵紊乱、离子失衡、谷氨酸释放、神经元内钙超载，进而引发氧化应激、炎症反应等一系列瀑布样病理变化，最终导致细胞的凋亡和死亡[18]。谷氨酸受体依赖和非谷氨酸受体依赖的途径均可导致钙超载[19]，既往对谷氨酸依赖性钙超载途径研究占据主要地位[20]，然而谷氨酸受体阻断剂在临床中的应用并不理想[21]。实验研究发现，OGD 时间延长至1.5 h 时，谷氨酸受体阻断剂已不能发挥神经元保护作用，细胞死亡的原因主要是由于通过非特异性的阳离子通道导致的钙超载，其在脑缺血后离子失衡及细胞死亡中也发挥着相当重要的作用[20，22-23]。目前发现的非谷氨酸受体依赖钙超载的机制主要包括ASICs[6]、TRP[5]、ATP 敏感性钾通道（KATP）[24]、半通道[25]等。

TRP 通道家族是一大类非特异性阳离子通道的集合，其中TRPM 是其一类亚族，TRPM2 和TRPM7 与脑缺血迟发性的钙超载密切相关[20]。TRPM7 在缺血缺氧时脑损伤和神经元细胞死亡中起关键作用[26]。用SiRNA 抑制 TRPM7 的表达，可以明显抑制OGD 3 h 以上的Ca2＋内流[5]，并阻止ROS 介导的一系列反应。目前，最有效和特异的TRPM7 抑制剂是waixenicin A，可减轻脑缺血缺氧损伤，TRPM7 是一种新兴的药物靶点[26]。本研究发现脑心通通过抑制非谷氨酸受体依赖途径中的TRPM7 表达从而减轻神经元OGD/R 损伤。为脑心通治疗缺血性脑卒中提供了实验依据和初步探索方向。