黑曲霉N5-5产单宁酶的酶学性质与固定化

何泽琪，刘果，阚启鑫，杨国航，曹庸

（华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

单宁是仅次于木质素的第二大类植物多酚，被认为是难降解、难消化且对机体有毒害的物质[1]。单宁酶作为单宁酸分解技术相关的重要酶类，因其安全性较高而被广泛研究。单宁酶（EC，3.1.1.20）是一种广泛存在于微生物和植物中的诱导酶，尤其是在以单宁酸为原料的丝状真菌中可以大量生产[2]。单宁酶的主要特征是它对复杂的多酚具有活性，如可水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖[3]，还能够水解复合型单宁、没食子酸烷基酯以及绿原酸等物质[4]。因此单宁酶已被广泛应用于食品，饮料，酿造，医药，化工等行业[5]。

目前单宁酶生产的主要方法为微生物发酵法，对曲霉属、青霉属、根霉属的真菌及乳杆菌等细菌发酵生产单宁酶的报道较多。液体深层发酵和固态发酵是生产单宁酶的两种主要方式，它们各有利弊：固态发酵生产的单宁酶主要是胞外酶，具有易回收、酶活高、稳定性好等优点，但不利于均匀调控；液体发酵虽代谢参数易于调控，但发酵所得单宁酶酶活不高且回收成本较高[6]。故本研究以液体扩培形成菌丝体，结合常规固体发酵的方式，对黑曲霉进行培养。

游离单宁酶在使用过程中存在热稳定性差、使用寿命短、回收重复利用难等缺点，这极大地限制了单宁酶的工业运用[7]。常规的喷雾干燥、冷冻干燥等手段，能使酶延长存储时间。除此之外，采用有效的固定化技术制备固定化单宁酶，可以将单宁酶多次循环使用从而降低单宁酶使用成本，还可以提高单宁酶的理化性质及生物稳定性[8]，人们将单宁酶固定到载体上来改善其使用性能，常使用的固定化载体有壳聚糖、玉米芯等[9,10]。树脂材料由于类型多、成本低且具有稳定的理化性质，也被用作为酶的固定化载体[10]，且很多已实现了商业化生产。黑曲霉N5-5为本课题组自行筛选和诱变选育的一种单宁酶高产菌株，前期均以小规模进行实验，研究发现具有良好的水解没食子酸丙酯能力[11]。为了黑曲霉 N5-5发酵产单宁酶的进一步研究与推广，本研究对酶进行扩培，研究其酶学性质，并进行纯化、干燥、固定化等步骤的试验，以期为N5-5所产单宁酶的工业化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

黑曲霉N5-5（保藏号：CCTCC M 2014051）：华南农业大学食品学院广东省天然活性物食品实验室-80 ℃冻存；树脂：购自杭州科创有限公司；麸皮：购自永和饲料厂。

1.1.2 主要仪器设备

UV-VIS紫外分光光度计，日本岛津；TUS-200型振荡型恒温金属浴，上海一恒科学有限公司；DHZ-C型恒温振荡器，太仓市强乐实验设备有限公司；FD-1PF型立式冷冻干燥机，北京德天佑科技发展有限公司；生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；液相色谱、DHG-970电热恒温鼓风干燥箱，上海齐心科学仪器有限公司；LC-10Avp plus分析型高效液相色谱，日本岛津。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制

斜面培养基：取2 g PDA成品培养基，自然pH，定容至50 mL，加热溶解分装于试管中，121 ℃灭菌20 min。

液体培养基：称取单宁酸20 g，蔗糖10 g，硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸铁0.01 g，硫酸镁0.5 g，定容至 1 L。50 mL每瓶分装于 200 mL培养瓶中，121 ℃灭菌20 min。

固体培养基：称取麸皮450 g，硝酸铵5 g，硫酸镁0.5 g，氯化钠0.5 g，磷酸二氢钾4 g，单宁酸460 g，加蒸馏水500 mL，121 ℃灭菌20 min。

柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液配制：称取柠檬酸2.10 g和柠檬酸三钠2.94 g，分别溶解并于100 mL容量瓶中定容，二者浓度均为0.1 mol/L。将柠檬酸与柠檬酸三钠溶液1:2体积比混合，得柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液（下简称柠檬酸缓冲液）。

1.2.2 黑曲霉N5-5发酵培养

1.2.2.1 液体扩培

参考Jana[12]等的方法，略有修改。将黑曲霉N5-5接种于PDA斜面，30 ℃培养54 h进行活化。用15 mL已灭菌的 0.9%生理盐水将孢子洗下，形成孢子悬浮液。每瓶液体培养基中加入 1 mL孢子悬浮液，置于30 ℃摇床中震荡培养72 h。

1.2.2.2 固体发酵

将液体培养所得菌丝体溶液，以100 mL/kg比例加入固体培养基中，翻拌均匀。30 ℃发酵6 d。

1.2.3 单宁酶酶液制备

1.2.3.1 粗酶液的制备

固体发酵结束后，参照张帅[13]等的方法进行提酶，略有修改。固体培养基中加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，培养基与缓冲液按质量比1:1混合，并充分搅拌浸提 1 h。得到的混合物先用四层纱布过滤去除大颗粒杂质，再用150目滤布过滤，所得滤液即为粗酶液。

1.2.3.2 酶液的纯化

将粗酶液用截留分子量为 60 ku的陶瓷膜进行过滤浓缩，得到陶瓷膜过滤液和截留液，并检测理化性质及酶活。

1.2.4 单宁酶理化性质的研究

1.2.4.1 固形物含量

取洁净的培养皿，置烘箱内105 ℃干燥后冷却至室温称重，重复此过程至连续两次干燥后称重差异在0.5 mg以下。取 1 mL搅拌均匀的酶液于培养皿中，105 ℃烘箱干燥5 h。5 h后迅速取出放入干燥器中，冷却至室温后称重。同样重复此干燥过程至样品连续两次干燥后称重差异在0.3 mg以下。

1.2.4.2 蛋白含量

采用考马斯亮蓝法[14]。以BSA为标准蛋白，与考马斯亮蓝G-250试剂作用后，在595 nm波长处测定吸光度。以标准蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，建立标准曲线。1 mL样品溶液按上述步骤操作，蛋白质量浓度可由标准曲线求出。得到回归方程Y=0.0057X，R2=0.9859，可见该曲线拟合良好，可作为样品中蛋白质量浓度计算的方程模型。

1.2.5 酶活的测定

酶解反应体系：500 μL酶液+500 μL 10%单宁酸，45 ℃反应12或24 h。后以100 ℃，20 min灭活。（另做空白扣除单宁酸自身分解的影响：酶液先以100 ℃加热20 min灭活，然后迅速冰浴降温，再加入500 μL的10%单宁酸进行反应），反应一定时间后测定酶活。

1.2.5.1 薄层层析快速检测酶活

展开剂：甲苯:乙酸乙酯:甲酸=10:18:2；显色剂：0.1%的氯化铁溶液（无水乙醇定容）；将硅胶板于105 ℃，活化0.5 h后冷却至室温。样品点样量为2 μL，于层析缸中展开。展开到3/4高度左右，取出硅胶板，晾干，喷显色剂或紫外下显色。

1.2.5.2 高效液相色谱定量检测

参照张迎杰[15]的检测方法，略有改动。样品统一稀释100倍，过膜后进液相检测；流动相为0.1%磷酸水与甲醇，检测波长为275 nm，进样量10 μL，流速1 mL/min；洗脱程序为0~10 min，甲醇浓度10%；10~20 min，甲醇浓度10%~90%；20~25 min，甲醇浓度90%。

1.2.5.3 没食子酸标曲的制作

选取5个浓度的没食子酸溶液，按2.3.2条件进行液相色谱分析。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标得到标准曲线，计算得到回归方程Y=3×107X-542909，R2=0.995，可见该曲线拟合良好，可作为样品中蛋白质量浓度计算的方程模型。

1.2.6 单宁酶活力的研究

1.2.6.1 酶解能力与底物浓度的探索

将纯化后酶液冻干，复溶后配置成冻干前蛋白浓度，分别与 10%、20%、30%、40%、50%浓度的单宁酸反应。检测方法同2.4。

1.2.6.2 干燥方式对酶活的影响

为考察不同干燥方式对酶活力的影响，本实验选用喷雾干燥及冷冻干燥两种方式进行试验。酶的喷雾干燥方法为，使用3 L陶瓷膜截留液，按固形物含量配比20%添加558 g麦芽糊精。使用高压均质机15~20 kPa均质后进行喷雾干燥。喷雾干燥条件为进风温度98 ℃，出风温度 50 ℃，雾化器 40 Hz，恒流泵50 r/min。酶的冷冻干燥则使用冻干机-40 ℃冷冻干燥，直至酶液完全冻干。将酶粉分别复溶至与粗酶液相同蛋白浓度，按方法2.4检测酶活

1.2.6.3 酶的固定化

将冻干酶粉复溶成0.1 g/mL，取10 mL加入10 g树脂，搅拌均匀放入 40 ℃鼓风干燥机，后每小时搅拌一次，确保树脂与酶液混合均匀。测定酶活时取0.5 g固定化酶加入500 μL 10%的单宁酸；另为了测试固定化的稳定性及重复利用率，在反应后过滤出树脂，重复使用1周测定其活力。

1.2.7 酶活力定义

单位体积粗酶液每分钟水解底物单宁酸产生 1 μmol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活力单位（U/mL）。

1.2.8 数据处理

各试验均进行3次平行测定，结果用“均值±标准偏差”表示。用SPSS（IBM SPSS，Armonk，NY）软件进行数据拟合以及回归分析。

2 结果与讨论

2.1 单宁酶的纯化

2.1.1 酶液理化性质的检测

对纯化前后酶液进行研究，为了对其进行定量，测定固形物含量及蛋白质含量，结果如表1。陶瓷膜截留液固形物含量为 49.34 mg/mL、蛋白含量 1.35 mg/mL，与粗酶液相比两项指标皆增长；而陶瓷膜滤液两项指标较粗酶液均有下降，初步推测所需单宁酶大多于截留液中（表1）。后续实验均根据蛋白含量进行统一定量后，对比酶活。

表1 纯化前后酶液固形物及蛋白质含量对比(mg/mL)Table 1 Comparison of solid content and protein content of enzyme solution before and after purification

2.1.2 薄层色谱层析检测纯化效果

为了测定单宁酶活力及纯化效果，将单宁酶粗酶液、单宁酶滤液、单宁酶截留液统一配制成蛋白浓度为0.7 mg/mL的酶液，分别与单宁酸反应12 h后，薄层层析检测结果图1。样品从左至右分别为：10%的单宁酸标品，1 mg/mL的没食子酸标品；灭活粗酶液反应体系（空白）；陶瓷膜滤液反应体系；陶瓷膜截留液反应体系；粗酶液反应体系。由图1可看出，在相同反应条件下，过滤液与截留液都能分解单宁酸生成没食子酸，但截留液比过滤液没食子酸特征点颜色更深，酶活更高。另外截留液酶解效果比粗酶液更佳，说明用陶瓷膜对粗酶液进行纯化达到一定的效果。陶瓷膜截留液的没食子酸特征点颜色最深，也说明转化生成没食子酸最多，即单宁酶主要在 60 ku陶瓷膜截留液组分中。这与前期实验结果中，黑曲霉N5-5所产单宁酶为分子质量64.2 ku的单肽链蛋白相符合[16]。

图1 单宁酶酶活初步检测薄层层析图Fig.1 TLC diagram of preliminary detection of tannase activity

单宁酶分子质量在 31~320 ku之间，由单个或多个亚基组成[17]，不同来源的单宁酶分子质量差异较大。真菌单宁酶均为糖蛋白，存在同源或异源低聚体，有两个以上亚基[18]，故真菌单宁酶分子质量较细菌单宁酶偏大，在45~320 ku之间[19]。实验所得结果与这些结论一致，故后续实验均选择含有大量单宁酶的陶瓷膜截留液，即纯化的酶液，作为研究对象。

2.1.3 HPLC测定纯化后酶液活性

金属浴45 ℃反应24 h后，通过HPLC准确测定酶活。

图2可看出，陶瓷膜截留液的组分没食子酸特征峰响应值高，通过计算峰面积发现，纯化后蛋白含量为0.7 mg/mL的酶液与10%的单宁酸反应24 h，单宁酸分解率可达到95%以上。

图2 纯化后酶液活性检测Fig.2 Activity detection of purified enzyme solution

2.2 单宁酶活力的探索

2.2.1 不同干燥方式对单宁酶活性的影响

酶作为生物催化剂，优点是具有针对性，效率高等。但缺点是处于游离状态的酶对环境很敏感，如在强酸、强碱、高温等情况中不稳定，酶蛋白变性导致活性降低甚至失活[7]。本研究分别用两种不同干燥方式干燥单宁酶截留液，使其易于保存。将干燥样品统一复溶成与粗酶截留液相同的蛋白浓度 1.35 mg/mL后分别与10%单宁酸反应，对其进行酶活检测，具体结果如图3。

图3 不同干燥方式的单宁酶活力对比图Fig.3 Comparison of tanninase activity of different drying methods

由图3可知，两种干燥方式干燥后的酶与单宁酸反应后，没食子酸生成量均较高，单宁酸含量变低，说明不同干燥方式的样品都具有较好的酶活。通过对比单宁酸减少量发现，冻干酶比喷干酶反应体系的单宁酸特征峰小；另外，冻干酶与未经干燥处理的纯化酶液都可将10%单宁酸基本反应完全，说明冻干对酶液活力影响较小。通过计算酶活，得喷干酶液酶活为174.02 U，而冻干酶液酶活为266.07 U，与纯化酶液的酶活相近。对每一处理步骤进行固形物、蛋白含量、酶活力等指标的测定，总结如表2。

表2 各步骤蛋白含量及酶活总结Table 2 Summary of protein content and enzyme activity in each step

此次大批量发酵所测酶活与实验室前期小批量发酵所测酶活471.35 U/mL[13]有差距，分析原因主要有两个。一是前期使用没食子酸丙酯作为酶解底物标定酶活，而本次为了解决生产实际问题，使用构成更为复杂的单宁酸作为底物，故酶活力定义的标准不同，前期酶活只作为参考值；二是由于发酵量大，实际发酵过程中培养基有部分结团，故对浸提酶液这一步产生影响，酶未能提取完全，后期可采用先机械打散再浸提，或二次浸提的方式改善。

2.2.2 酶活与底物浓度

由上述结果可知，冻干对酶活影响小，故使用冻干酶探究单宁酸浓度对酶活的影响。将冻干后的纯化酶液配置成1.35 mg/mL蛋白浓度分别与10%、20%至50%的单宁酸反应（图4）。根据单宁酸的减少量可以看出，酶与底物1:1的条件下反应24 h，可催化10%、20%的单宁酸完全转化成没食子酸；对30%浓度的单宁酸，单宁酸几乎被完全酶解解，但中间产物并未完全转化成没食子酸；而对于40%、50%的单宁酸，单宁酶酶解大部分单宁酸，但依旧剩下少量单宁酸未被酶解。有研究表明，单宁酶的反应速度与底物呈线性关系，低浓度时表现为一级反应；当到达一定浓度时，速度增加缓慢并趋于最大值，呈零级反应[20]。结论与本次实验结果相似，从30%底物浓度开始，没食子酸生成量变化不明显，酶解过程的零级反应拐点应处于30%附近，即30%单宁酸为合适的底物浓度。

图4 酶与不同浓度单宁酸反应HPLC对比图Fig.4 HPLC comparison chart of the reaction between enzyme and different concentrations of tannic acid

2.3 固定化酶的循环使用

为了对固定化酶的效果进行更准确的定性，对其使用时间及重复使用次数进行探究。每次0.5 g固定化酶与10%单宁酸反应24 h，重复使用6次，使用时长7 d，酶活检测结果如图5。

图5 固定化酶使用次数活性检测图Fig.5 Activity detection diagram of the number of times the immobilized enzyme is used

由图5可知，经过固定化后的酶，随时间延长，未被酶解的底物单宁酸含量逐渐增多。循环使用的前四次单宁酸基本反应完全，第5次检测结果中单宁酸剩余量明显增多，酶活降低70%左右。具体酶活变化总结见表3。固定化酶循环使用次数与底物浓度、作用时间和其他反应条件有很大关系，在实际应用过程中，根据生产情况减少底物浓度及作用时间，可增加固定化酶的循环使用次数。

表3 固定化酶活力循环使用次数与酶活Table 3 Number of cycles of immobilized enzyme activity and enzyme activity

3 结论

本研究对黑曲霉 N5-5固态发酵产单宁酶的条件进行优化，提酶后利用膜过滤技术纯化粗酶液，纯化后49.34 mg酶液干基含有1.35 mg单宁酶，酶活为258.53 U/mL，比活力为191.57 U/mg，所得单宁酶在1.35 mg/mL蛋白浓度下具有酶解10%至50%浓度单宁酸的能力；对比不同干燥方式对单宁酶活力的影响发现，冷冻干燥比喷雾干燥酶活损失少，从保证酶活的角度，可选择冻干的方式对单宁酶进行干燥保存；固定化后的单宁酶在实验条件下，可重复使用至少 4次，第5次酶活损失达70%。本文所提供的单宁酶提取等工艺，为单宁的绿色分解及没食子酸的绿色生产奠定基础，同时固体发酵所使用的材料利用了人类生产生活中的农林业废弃物，有利于环境和能源的可持续发展。为了更好地进行商业化应用，今后的研究可继续从发酵后酶的提取及固定化两方面入手，使单宁酶更高效更充分地发挥作用。