白扁豆非淀粉多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠的降血糖降血脂作用

付王威，吴睿婷，万敏，李睿城，初悦雷，吴琼琳，李文娟

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047）（2.南昌大学口腔医学院，江西南昌 330031）

糖尿病是一种以高血糖为病症的慢性代谢性疾病，伴有糖、脂、蛋白及电解质紊乱[1]。据国际糖尿病联盟统计，2019年世界成年糖尿病患病率高达9.3%，患者约4.38亿人，其中中国患者最多，约1.16亿人，预计到2045年，世界成年患者将攀升至7亿人[2]。当前，临床上确诊的糖尿病主要为Ⅱ型糖尿病，约占患者总数的90%[3]。研究已证实长期高浓度血糖可引起机体脑、心、肾、眼球、血管等多处器官的损伤和病变，各种并发症多达100多种[4]，严重影响了人类的生理健康和生活质量[5,6]。

传统饮食讲究“五谷宜为养，失豆则不良”。白扁豆是中国的传统食物，又称藊豆、白藊豆和南扁豆，富含碳水化合物、蛋白质、矿物质等多种营养素，营养价值较高[7]。近年来，研究发现白扁豆具有降血糖降血脂的作用，可作为糖尿病人饮食的优先选用食物之一[8,9]。多糖是一类通过醛糖或酮糖，以糖苷键连接在一起的高分子多聚化合物，在此基础上，非淀粉多糖被定义为不含淀粉组分的、通过在大肠中完全或部分发酵而被机体利用的复合多糖[10]。徐思绮[11]等以黑木耳非淀粉多糖为研究对象，证实了该非淀粉多糖具有降血糖作用，为非淀粉多糖的开发利用提供了基础研究数据。目前，豆类多糖生物学活性方面的研究报道较多，在糖尿病防治领域被广泛研究[12]，然而非淀粉多糖的降血糖降血脂作用研究较少，且有关白扁豆来源非淀粉多糖的研究尚未见报道。团队前期从白扁豆成熟种子中提取纯化出一种非淀粉多糖（Non-starch polysaccharide from dolichos lablab L，NS-DLP），平均分子量约为2.3×105u，由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖酸、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，具备良好的抗氧化功能[13]。本实验通过高糖高脂饮食结合STZ尾静脉注射建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型，观察和研究NS-DLP对Ⅱ型糖尿大鼠的影响，以期为白扁豆资源的综合利用和多糖功能性产品的研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

清洁级Wistar大鼠，体重180~220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。

白扁豆，安徽济顺中药饮片有限公司；链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ），美国Sigma公司；血糖试纸，罗氏诊断产品（上海）有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；INS测定试剂盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、过氧化氢酶（Catalase，CAT）测定试剂盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；大鼠白介素 6（Interleukin-6，IL-6）测定试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）测定试剂盒，博士德生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

血糖仪，罗氏诊断产品（上海）有限公司；Dimension RXLMAX型全自动生化分析仪，德灵诊断产品有限公司；3K15高速台式离心机，德国 Sigma公司；3001全波长扫描式多功能读数仪（多功能酶标仪），美国Thermo公司；KZ-II组织破碎仪，武汉塞维尔生物科技有限公司；AL104型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 白扁豆非淀粉多糖（NS-DLP）的提取制备

参照团队前期发表文献中的实验方法制备NS-DLP[14]。将白扁豆实体进行粉碎后，加入 95%乙醇溶液，室温浸泡过夜，过滤液体；滤渣加入蒸馏水，100 ℃下蒸煮5 h，过滤；依次进行淀粉酶、蛋白酶、糖化酶除杂，高温灭活后过滤、浓缩；加入95%乙醇溶液，4 ℃下沉淀多糖；醇沉后，4000×g离心10 min，加水复溶，Sevage法去除游离蛋白质，旋蒸、透析、浓缩、冻干。

1.3.2 Ⅱ型糖尿病大鼠模型建立

清洁级 Wistar雄性大鼠饲养于清洁卫生的环境（室温25±2 ℃、相对湿度50%±5%，昼夜明暗交替12 h/12 h），自由饮食饮水。适应性喂养一周后，选取6只大鼠作为正常组（Control组），喂以基础饲料，24只大鼠作为实验组，喂以高糖高脂饲料（66.5%基础饲料、10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、1%胆酸钠)[15]。8周后，实验组大鼠禁食12 h，尾静脉注射30 mg/kg bw STZ（溶解在0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，pH为4.4），Control组大鼠注射同等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。一周后测定空腹血糖（Fasting blood-glucose, FBG），FBG连续两次超过11.1 mmol/L即造模成功[16]。

1.3.3 动物分组及处理

将Ⅱ型糖尿病大鼠随机分为4组：模型组（STZ组）、NS-DLP低剂量组（LD组，NS-DLP 25 mg/kg bw）、中剂量组（MD组，NS-DLP 50 mg/kg bw）、高剂量组（HD组，NS-DLP 100 mg/kg bw），每组6只，将 NS-DLP溶于超纯水中，每日灌胃一次，Control组和STZ组给予同等剂量超纯水。4周后，所有大鼠禁食12 h，进行眼底静脉取血、处死、解剖，收集胰腺组织备用。

而在化学实验教学中加入信息化的技术，把既能够减少化学实验产生的环境污染，又能够满足学生的教学要求，让学生深刻理解化学反应过程的进行.

1.3.4 血清指标测定

血液静置2 h后，4 ℃ 3500 r/min 离心10 min，收集血清。采用全自动生化分析仪检测FBG、血清总胆固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平；采用胰岛素（Insulin，INS）试剂盒测定血清INS水平。

1.3.5 胰腺组织病理切片观察

采用预冷的生理盐水洗去胰腺表面的血渍，滤纸拭干，剔除脂肪。取部分胰腺组织固定于10%福尔马林溶液中，进行石蜡包埋、切片、苏木素-伊红染色等处理，利用光学显微镜观察胰腺组织胰岛区域的病理学变化并拍照。

1.3.6 胰腺组织炎症因子指标测定

取部分胰腺组织，以1:9的比例加入生理盐水，60 Hz低温匀浆1 min，4 ℃ 5000 r/min 离心15 min，取上清液。严格按照IL-6和TNF-α测定试剂盒说明书检测匀浆液中IL-6和TNF-α的含量。

1.3.7 胰腺组织氧化应激指标测定

取部分胰腺组织，以1:9的比例加入生理盐水，60 Hz低温匀浆1 min，4 ℃ 5000 r/min 离心15 min，取上清液。严格按照SOD、CAT和MDA测定试剂盒说明书检测匀浆液中SOD、CAT的活性与MDA含量，并使用 BCA蛋白浓度测定试剂盒检测匀浆液中蛋白质含量。

1.4 数据处理与分析

2 结果与讨论

2.1 NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠血清 FBG的影响

本实验通过FBG指标评价NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠血糖的影响，各组FBG水平如图1所示。与Control组大鼠 FBG水平相比（4.37 mmol/L），STZ组大鼠 FBG水平（29.05 mmol/L）极显著上升（p<0.01）；进行NS-DLP处理4周后，LD和MD组大鼠FBG水平显著下降（p<0.05），HD组大鼠FBG水平极显著下降（p<0.01），下降幅度分别为8.60%、8.87%和10.36%。王彤[17]等以馒头作为标准参照食物，观察了Ⅱ型糖尿病患者进食不同干豆后的血糖变化，结果显示进食白扁豆血糖指数得到了显著降低。与大多数天然多糖[18,19]研究结果相似，本实验数据表明NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠具有一定的降血糖作用。

图1 NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠FBG的影响Fig.1 The effect of NS-DLP on FBG levels of type Ⅱ diabetic rats

2.2 NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠血脂水平的影响

大量研究已证实，高血脂与Ⅱ型糖尿病息息相关：一方面高浓度的血脂可与葡萄糖竞争进入细胞代谢，阻碍葡萄糖的氧化利用；另一方面高血脂可促使游离脂肪酸大量生成，游离脂肪酸不仅会干扰INS与其受体结合，而且能够直接破坏胰岛细胞的分泌功能，导致胰岛β细胞凋亡[20,21]。Nie[22]研究报道，车前子多糖可显著降低Ⅱ型糖尿病大鼠血清的TC、TG水平，提高HDL-C水平，部分改善LDL-C水平，进而缓解大鼠的脂代谢紊乱。邵红亮等[23]研究发现灌胃6周100 mg/kg bw红芪多糖，可将Ⅱ型糖尿病大鼠血清TC、TG和LDL-C水平分别降低8.11%、14.46%、14.58%，HDL-C水平提高17.02%。本实验研究得到了类似的结果，如图2，Control组大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C浓度分别为1.70、0.95、1.51和0.41 mmol/L。与Control组相比，STZ组大鼠血清TC、TG和LDL-C浓度分别极显著升高至 3.46、7.09、1.05 mmol/L（p<0.01），HDL-C浓度显著降低至 1.25 mmol/L（p<0.05），而灌胃给予NS-DLP可不同程度地改善该症状，其中，各组大鼠血清TC和LDL-C水平均下降，但结果无显著性差异，其原因可能在于多糖灌胃周期不够长，NS-DLP降TC和LDL-C作用尚未完全凸显；LD组大鼠血清 TG浓度显著降低至 5.29 mmol/L（p<0.05）；MD 组大鼠血清 TG 浓度极显著降低至4.90 mmol/L，HDL-C浓度极显著提升至1.65 mmol/L（p<0.01）；HD组大鼠血清 TG浓度显著降低 4.97 mmol/L（p<0.05），HDL-C 浓度极显著提升 1.61 mmol/L（p<0.01）。上述结果表明 NS-DLP可改善Ⅱ型糖尿病大鼠的血脂水平，其效果主要体现在降低TG水平和提高HDL-C水平，值得注意的是MD组大鼠指标略优于HD组，显示NS-DLP在机体内的有效作用与剂量之间没有呈现预期的正相关依赖关系，结合其他实验参数（大部分情况下，HD组大鼠指标均优于MD组大鼠），提示了NS-DLP体内作用模式较为复杂。

图2 NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠血脂水平的影响Fig.2 The effect of NS-DLP on blood lipids levels of type Ⅱdiabetic rats

2.3 NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺组织形态的影响

STZ作为一种广谱抗菌素，对实验动物胰岛β细胞具有高度选择性的损伤作用，在糖尿病动物模型建立中被广泛应用。其诱导糖尿病的机制可能是通过亚硝基脲产生自由基对胰岛β细胞造成损伤，导致胰腺组织病变和胰岛萎缩，从而诱发糖尿病[24]。与Li等[25]和Zhang等[26]试验结果相似，各组大鼠胰腺组织病理形态学变化如图3所示，Control组大鼠胰腺胰岛组织结构完整，近似椭圆，边界清晰圆润，细胞分布均匀、排列整齐。STZ组大鼠胰岛组织严重萎缩变形，边界不规则、模糊不清，细胞空泡变性。LD组、MD组和HD组较STZ组大鼠胰岛组织损伤有明显的改善，其中HD组效果最佳，胰岛面积显著增大，结构趋向完整，边界清晰，细胞数目增多。上述结果表明NS-DLP可减轻Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛组织病理性病变，对维系胰腺正常组织形态、结构具有保护作用，提示NS-DLP的降血糖降血脂作用与其对胰腺保护作用有关。

图3 NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺形态的影响（×400）Fig.3 The effect of NS-DLP on the morphology of pancreas of type Ⅱ diabetic rats (×400)

2.4 NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠血清INS水平的影响

胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）和INS分泌障碍是Ⅱ型糖尿病重要病理机制之一，不仅是其发生的驱动因素，而且贯穿于整个病情的发展。发病初期，患者出现IR，INS生物效应降低，此时机体会代偿性分泌更多的INS以维持血糖平衡[27]，但随着病情的发展，患者胰腺组织和胰岛功能逐渐病变，最终出现INS分泌障碍，导致FBS骤升[28]。胡吉蕾等[29]研究报道，赶黄草水提物可提高Ⅱ型糖尿病大鼠INS的葡萄糖吸收率和利用率，将INS水平显著降低15.78%（p<0.01）。本实验得到了相似的结果，由图4可知，Control组大鼠血清胰岛素含量为106.97 mIU/L，STZ组为178.03 mIU/L，上升幅度为 66.43%，结果具有极显著性（p<0.01），而灌胃给予NS-DLP均可降低糖尿病大鼠血清INS水平，其中HD组大鼠下降幅度达到26.36%，效果最优，结果具有显著性差异（p<0.05）。上述结果表明NS-DLP可降低Ⅱ型糖尿病大鼠血清INS水平，改善IR程度。

图4 NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠血清胰岛素水平的影响Fig.4 The effect of NS-DLP on serum INS levels of type Ⅱdiabetic rats

2.5 NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺炎症因子水平的影响

炎症与糖尿病胰腺功能紊乱的发病机理密切相关，炎症因子在Ⅱ型糖尿病患者胰腺中过量产生，引起胰岛β细胞功能障碍，导致胰岛素分泌失调。IL-6、TNF-α均为重要的炎症介质，对胰腺组织具有直接的损伤作用[30]，同时可加重脂肪、肌肉、肝脏等器官的IR，常作为胰腺炎严重程度的诊断指标[31]。沈蒙等[32]报道了灌胃黑豆皮可溶性膳食纤维可显著降低Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺TNF-α等炎症因子的水平，从而发挥胰腺保护作用。本研究得到了类似的结果，如图5所示，与 Control组相比，STZ组大鼠胰腺中 IL-6和TNF-α水平分别极显著升高了 79.93%和 67.96%（p<0.01）。与STZ组相比，LD、MD和HD组大鼠胰腺IL-6和TNF-α水平均下降，其中MD组IL-6的结果具有显著性差异，下降幅度为28.39%（p<0.05），HD组IL-6和TNF-α的结果具有极显著性差异，下降幅度分别 41.18%和 47.18（p<0.01）。上述结果表明NS-DLP可显著降低Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺的炎症水平。

图5 NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺IL-6、TNF-α水平的影响Fig.5 The effect of NS-DLP on pancreatic IL-6 and TNF-α levels of type Ⅱ diabetic rats

2.6 NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺氧化应激的影响

氧化应激是机体内自由基过量产生的负面效应，具体表现为氧化中间产物大量产生，内源性抗氧化剂显著减少，被认为是组织炎症和损伤的重要机制[33,34]。Ⅱ型糖尿病患者体内普遍存在氧化应激，段晋宁等[35]研究显示糖尿病大鼠的治疗作用与莪术多糖减轻胰腺氧化应激水平有关，中剂量组（500 mg/kg bw）可将Ⅱ型糖尿大鼠胰腺SOD和CAT水平由24.33和13.62 U/mg prot显著提升至28.03和16.39 U/mg prot，MDA水平由8.39 nmol/mg prot显著降至7.49 nmol/mg prot。借鉴郎茜等人[36]的研究，本实验检测了NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺氧化应激的影响，得到了类似的结果。

如表1所示，与Control相比，STZ组大鼠胰腺中SOD和CAT活力分别降低了7.09%和74.26%，MDA水平升高了 53.33%，结果具有极显著性差异（p<0.01），而灌胃给予NS-DLP可不同程度地改善该症状，其中低剂量NS-DLP对MDA水平的作用具有显著性差异（p<0.05），对SOD和CAT水平的作用具有极显著性差异（p<0.01），中、高剂量NS-DLP对三者的作用均具有极显著性差异（p<0.01）。上述结果表明 NS-DLP可提高Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺的抗氧化能力，降低脂质过氧化损伤水平。

表1 NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺MDA、SOD、CAT水平的影响Table 1 The effect of NS-DLP on pancreatic MDA, SOD and CAT levels of type Ⅱ diabetic rats

3 结论

本研究结果表明，NS-DLP对Ⅱ型糖尿病大鼠具有降血糖降血脂作用，可改善IR水平。在此基础上，通过对胰腺组织的病理学观察及相关生化指标的检测发现，其降血糖降血脂作用机制与其降低胰岛组织损伤和胰腺炎症水平，提高胰腺抗氧化活力有关。该结论可为NS-DLP防治糖尿病的研究提供一定的理论依据，后续将继续开展NS-DLP降血糖作用相关信号通路、代谢组学、肠道微生物组学的进一步研究，揭示NS-DLP降血糖的内在分子机制，推动白扁豆糖尿病膳食产品的研发。