反萃取降低高纯单宁酸生产中没食子酸残留量的应用

荆才，罗志军，胡鹏刚*，李家斌，何志鸿，王绍江，罗波，许晗

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025；3.贵阳单宁科技有限公司，贵州贵阳550200；4.贵州理工学院科技处，贵州贵阳550003）

反萃取降低高纯单宁酸生产中没食子酸残留量的应用

荆才1，罗志军3，胡鹏刚1*，李家斌3，何志鸿3，王绍江3，罗波4，许晗2

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025；3.贵阳单宁科技有限公司，贵州贵阳550200；4.贵州理工学院科技处，贵州贵阳550003）

为了进一步降低单宁酸中没食子酸残留量，以单宁酸为原料，采取萃取、反萃取等分离技术，以单宁酸中没食子酸残留量为评价指标，对提纯工艺进行优化。其最终优化工艺条件为选择pH 6.8的磷酸钠盐溶液作为反萃剂，单宁酸与乙酸乙酯固液比为1∶5 (g∶mL)，单宁酸与反萃液固液比为1∶2.5(g∶mL)。在此条件下单宁酸中没食子酸含量可降低到1%以内。

没食子酸；高纯单宁酸；萃取；反萃取；提纯优化

单宁酸（tannic acid，TA）又名丹宁酸、单宁，是植酸类物质，广泛存在于自然界中[1-2]，是水溶性有机物（dissolved natural organic matter，DOM）的重要组成部分[3]。单宁酸在天然产物中分布很广[4]，可从橡树[5-6]、五倍子[7]等植物中分离得到。单宁酸的分子质量在500～3 000 u，其定义是指能沉淀生物碱、明胶及其他蛋白质的水溶性多酚化合物[8]，是一类相对分子质量较高的多元酚类化合物[9]，具有较强的生物活性和药理活性[10]，与蛋白质有很强的结合能力，与生物碱、酶、金属离子等反应活泼，还有较强的表面活性，对一些人体的伤病具有直接的生物处理作用。经过毒理及药效学研究结果发现，此类化合物具有多种功效，如有明显体外抑菌效果[11]、止痛、止血、抗突变、抗脂质氧化[12-14]等，且具低毒、安全的特点。因此，单宁酸被广泛的应用在医药、食品、化妆品、制革、冶金、印染、选矿等工业生产上[15]。

单宁酸的理化性质使得其可同酒类中的可溶性敏感蛋白质结合，形成具有胶链结构的络合物沉淀析出，保证了啤酒生产过程中的澄清度，从而提高了非生物稳定性，延长了保质期，并且不影响啤酒的口感[16]。目前，国内啤酒年产量超过5 000万L，对单宁酸的需求量很大，市场前景广阔。同时，也对单宁酸的质量提出了更高的要求，即单宁酸含量越高越好，没食子酸残留量越低越好。

目前，国内生产单宁酸的企业主要或部分采用热水浸提、有机溶剂萃取、树脂吸附、酒精洗脱、冷冻澄清、浓缩干燥等工艺方法进行生产。本实验采用有机溶剂萃取法，萃取剂选用乙酸乙酯，其原因是乙酸乙酯相对于乙醇、丙酮等有机溶剂的亲水性差，可与水较好的分层分离，且乙酸乙酯沸点低，易回收，成本低，可反复进行使用。单宁酸在乙酸乙酯溶液和反萃（取）剂分配系数不同，通过萃取技术，极大部分单宁酸可以进入乙酸乙酯，从而达到提纯的目的；通过反萃取技术，可使一部分没食子酸从有机相乙酸乙酯中返回反萃液中，从而达到降低单宁酸中没食子酸残留量的目的。同时，反萃液中的没食子酸可以利用碱进行水解回收制备没食子酸。

本试验通过使用乙酸乙酯作为溶剂进行反萃取可以降低高纯单宁酸中没食子酸的残留量，对影响反萃取的各种因素的试验，获得降低高纯单宁酸生产中没食子酸残留量的最佳工艺，从而提高产品特征，增加产品的附加值，降低成本增加经济效益。同时，减轻污水的处理负担，提纯后产生的污水经过简单的处理即可达到国家污水排放标准。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

单宁酸（没食子酸含量3.82%）：由贵阳单宁科技有限公司提供；乙酸乙酯（食品级）：河南尉氏县香源香料有限公司；单宁酸标准品、没食子酸标准品（分析纯）：南京林化所；活性炭：黎平奥捷碳素有限公司；磷酸二氢钠（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；无水磷酸氢二钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；无水碳酸钠（分析纯）：重庆江川化工有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）：重庆吉元化学有限公司。

1.2 仪器与设备

JM-B10001型电子天平：余姚市纪铭称重校验设备有限公司；ATY224型分析天平：日本SHIMADZU公司；754型紫外可见分光光度计：天津市普瑞斯仪器有限公司；202-00型电热恒温干燥箱：沪南电炉烘箱厂；202-1AB型电热恒温干燥箱、DZ-1AⅡ真空干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；HH系列数显恒温水浴锅（箱）：金坛市科析仪器有限公司；HY-5回旋振荡器：金坛市富华仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 没食子酸的反萃取

按照不同比例将单宁酸、乙酸乙酯溶液、反萃取液分别加入1 000 mL的四口圆底烧瓶，在30℃条件下机械搅拌萃取30 min。反萃取液与单宁酸和乙酸乙酯溶液发生反萃取反应，将其中的没食子酸和其他一些杂质反萃取出来。然后倾于分液漏斗，于室温条件下静置分层，5 h左右后分离出反萃液。将反萃液和乙酸乙酯萃取液分别集中收集，前者用于碱水解回收没食子酸，后者用于制备单宁酸。

1.3.2 单宁酸样品的制备

将乙酸乙酯萃取液倒入四口圆底烧瓶回收乙酸乙酯溶液，15～30min后补加100mL高纯水，使单宁酸进入高纯水形成单宁酸水浓缩液，至蒸出的液体含极少或不含乙酸乙酯时停止。将单宁酸水浓缩液倒入烧杯煮沸，加一定量的活性炭进行吸附和脱色，趁热抽滤。将单宁酸滤液倒入培养皿，置真空干燥箱干燥，所得固体经过干燥后研碎装入样品袋，待检测单宁酸样品中没食子酸残留量。

1.3.3 单因素试验

根据前期试验综合分析单宁酸与乙酸乙酯固液比、单宁酸与反萃取液固液比、不同反萃（取）剂对降低单宁酸中没食子酸残留量有一定的影响，因此选择在30℃条件下进行萃取反应，考察单宁酸与乙酸乙酯固液比（1∶3、1∶4、1∶5、 1∶6、1∶7（g∶mL））、单宁酸与反萃取液固液比（1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0（g∶mL））、不同反萃剂（pH 6.8的磷酸钠盐溶液、高纯水、pH 7.5的磷酸钠钾盐溶液、1%Na2CO3溶液、3% Na2CO3溶液）对单宁酸中没食子酸残留量的影响，进行单因素试验。

1.3.4 正交试验

为了得到降低单宁酸中没食子酸残留量的最佳工艺条件，以单宁酸与乙酸乙酯固液比、单宁酸与反萃取液固液比和不同反萃剂作为考察因素，根据单因素试验结果选择3个水平，以单宁酸中没食子酸残留量为考察指标，按L9（34）正交试验表设计试验。正交试验因素水平见表1。

表1 反萃取没食子酸工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for gallic acid counter extraction process optimization

1.3.5 样品测定方法

单宁酸中没食子酸含量按照国家林业行业标准LY/T 1642—2005中《单宁酸分析试验方法》进行检测。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 单宁酸与乙酸乙酯固液比对没食子酸残留量的影响

单宁酸与磷酸钠盐溶液（pH 6.8）固液比1∶2（g∶mL）、30℃条件下萃取30 min，考察单宁酸与乙酸乙酯固液比对单宁酸中没食子酸残留量的影响，其结果见图1。

图1 单宁酸与乙酸乙酯固液比对单宁酸中没食子酸含量的影响Fig.1 Effect of tannic acid to ethyl acetate ratio on gallic acid content in tannin acid

由图1可知，随着单宁酸与乙酸乙酯固液比的增高，单宁酸中没食子酸残留量总体呈现下降趋势，在乙酸乙酯固液比1∶5时没食子酸残留量有明显下降，之后波动不太明显，趋于平缓，可能是过量的乙酸乙酯溶液将大部分单宁酸吸收，而反萃取液反萃取没食子酸已到达或接近饱和致使单宁酸中没食子酸残留量保持在一定的值附近。因此，选择单宁酸与乙酸乙酯固液比为1∶5（g∶mL）。

2.1.2 单宁酸与反萃取液固液比对没食子酸残留量的影响

单宁酸与乙酸乙酯溶液固液比1∶5（g∶mL），30℃条件下萃取30 min，考察单宁酸与反萃取液固液比对单宁酸中没食子酸残留量的影响，结果见图2。

图2 单宁酸与反萃液固液比对单宁酸中没食子酸含量的影响Fig.2 Effect of tannic acid to stripping agent ratio on gallic acid content in tannin acid

由图2可知，在单宁酸与反萃取液固液比1∶2.0～1∶4.0（g∶mL）范围内，单宁酸中没食子酸残留量先下降，在单宁酸与反萃取液固液比为1∶3.0（g∶mL）时没食子酸残留量最低，1∶3.0（g∶mL）后又上升。可能是由于反萃取液过量，促进单宁酸的水解使得没食子酸残留量增高。同时，由于溶液中的钠盐离子增多，单宁酸的氧化性质使得溶液出现不溶絮状物，增大了酯相和水相的分离难度，也降低了单宁酸的含量。故选择单宁酸与反萃取液固液比1∶3.0（g∶mL）。

2.1.3 不同反萃剂对没食子酸残留量的影响

单宁酸与乙酸乙酯溶液固液比1∶5（g∶mL）、单宁酸与反萃取液固液比1∶3（g∶mL），30℃萃取30 min，考察不同反萃剂对单宁酸中没食子酸残留量的影响，结果见图3。

图3 反萃剂对单宁酸中没食子酸含量的影响Fig.3 Effects of stripping agent on gallic acid content in tannin acid

由图3可知，使用a（pH 6.8的磷酸钠溶液）时，单宁酸中没食子酸残留量最低，为1.02%，其次是b（pH 7.5的磷酸钠钾盐）和c（高纯水），d（1%的Na2CO3溶液）pH值约为9，e（3%的Na2CO3溶液）pH值约为12，后两种反萃剂由于pH值太高，对后期的污水处理带来较大的不便，并且在静置分层时生成大量不溶物，造成了工艺过滤困难。由于单宁酸受pH值影响较大，在碱性条件下易发生氧化，且随着pH值增加，氧化加剧。所以在整个制备过程中，其反应环境的pH值必须加以控制，尤其在生产阶段，更加要注重这个问题。故选择磷酸钠盐溶液（pH 6.8）作为反萃剂。

2.2 正交试验结果分析

正交试验的结果与分析如表2所示，方差分析见表3。

表2 反萃取没食子酸正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for counter extraction process optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2直观结果显示，第6组反萃取效果最好，得到单宁酸中没食子酸残留为0.99%。由极差分析可以得出最优水平组合为A2B1C1，即单宁酸与乙酸乙酯固液比1∶5（g∶mL），单宁酸与反萃取液固液比1∶2.5（g∶mL），选择磷酸钠盐溶液（pH 6.8）作为反萃剂。根据表3数据显示，由极差分析可以看出3个因素对单宁酸中没食子酸残留量效果影响程度的大小为反萃剂（C）＞单宁酸与乙酸乙酯固液比（A）＞单宁酸与反萃取液固液比（B）。由表3方差分析可以看出，单宁酸与乙酸乙酯固液比对单宁酸中没食子酸残留量影响显著，单宁酸与反萃取液固液比对单宁酸中没食子酸残留量影响不显著，反萃剂对单宁酸中没食子酸残留含量有极显著影响。由于最优组合没有出现在正交表中，在最优条件下进行验证试验，结果表明，最终单宁酸中没食子酸残留量降至1%以内。所以最终优化工艺条件为单宁酸与乙酸乙酯固液比1∶5（g∶mL），单宁酸与反萃取液固液比1∶2.5（g∶mL），选择磷酸钠盐溶液（pH 6.8）作为反萃剂。

3 结论

为了满足当前啤酒市场对低没食子酸残留量的高纯度食品级单宁酸的需求，本试验采用萃取、反萃取、活性炭吸附等分离提纯技术对单宁酸中的没食子酸残留量进行分离去除，从而降低高纯度单宁酸中没食子酸的残留量。根据其结果显示，经过单因素试验和正交试验得到反萃取降低单宁酸中没食子酸残留量的最佳工艺条件，即选择pH6.8的磷酸钠盐溶液作为反萃剂，单宁酸与乙酸乙酯固液比为1∶5（g∶mL），单宁酸与反萃取液固液比为1∶2.5（g∶mL）。在此条件下进行分离反萃取可降低单宁酸中没食子酸残留量在1%以内。该方法操作简便可行，提纯效果好，且生产成本低，适用于工业规模化生产。

1]VREYSEN S,MAES A.Adsorption mechanism of humic and fulvic acid onto Mg/Al layered double hydroxides[J].Appl Clay Sci,2008,38(3-4): 237-249.

[2]WANG J N,LI A M,WANG Q J,et al.Assessment of the manganese content of the drinking water source in Yancheng,China[J].J Hazard Mat,2010,182(1-3):259-265.

[3]周扬，王津南，许丽，等.丙烯酸酯基吸附树脂对水体中单宁酸和没食子酸的吸附研究[J].离子交换与吸附，2010，26（3）：202-209.

[4]ROSS K A,BETA T,ARNTF S D.A comparative study on the phenolic acids identified and quantified in dry beans using HPLC as affected by different extraction and hydrolysis methods[J].Food Chem,2009,113 (1):336-344.

[5]DOUSSOT F,PARDON P,DEDIER J,et al.Individual,species and geographic origin influence on cooperage oak extractible content(Quercus roburL.andQuercus petraeaLiebl.)[J].Analusis,2000,28(10):960-965.

[6]LEI Z,JERVIS J,HELM R F.Use of methanolysis for the determination of total ellagic and gallic acid contents of wood and food products[J].J Agr Food Chem,2001,49(3):1165-1168.

[7]林栩.植物单宁[J].中国皮革，2007，36（7）：5-7.

[8]钱彩虹，吴谋成.植物单宁制备方法研究进展[J].现代农业科学，2009（3）：55.

[9]魏海峰.单宁酸对实验性糖尿病大鼠肾脏病变的改善作用及其机制的研究[D].长春：吉林大学，2010.

[10]王音.单宁酸与固定化胰蛋白酶相互作用的研究[J].山西师范大学学报：自然科学版，2014，28（3）：45-48.

[11]徐云凤，李光辉，梁秀君，等.石榴皮单宁的提取、纯化及抑菌作用的研究[J].食品工业科技，2014，35（2）：83-86.

[12]SERKEDJIEVA J,IVANCHEVA S.Antiherpes virus activity of extracts from the medicinal plantGeranium sanguineumL.[J].J Ethnopharmacol,1999,64(1):59-68.

[13]SÁNCHEZ-MORENO C,JIMÉNEZ-ESCRIG A,SAURA-CALIXTO F. Study of low-density lipoprotein oxidizability indexes to measure the antioxidant activity of dietary polyphenols[J].Nutr Res,2000,20(7): 941-953.

[14]SCHUBERT S Y,LANSKY E P,NEEMAN I.Antioxidant and eicosanoid enzyme inhibition properties of pomegranate seed oil and fermented juice flavonoids[J].J Ethnopharmacol,1999,66(1):11-17.

[15]陈笳鸿，汪咏梅，吴冬梅，等.单宁酸纯化技术的研究开发[J].现代化工，2008，28（S2）：301-304.

[16]王家林，薛长湖，付雪艳，等.酿造单宁在啤酒高浓酿造中应用效果的评价及其影响因素的探讨[J].食品与发酵工业，2005，31（8）：30-33.

Application of counter extraction in gallic acid reduction during high-purity tannin acid production

JING Cai1,LUO ZhiJun3,HU Penggang1*,LI Jiabin3,HE Zhihong3,WANG Shaojiang3,LUO Bo4,XU Han2
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.School of Chemistry and Chemical Engineering, Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Guiyang Gallotannin Co.,Ltd.,Guiyang 550200,China;4.Department of Science and Technology,Guizhou Institute of Technology,Guiyang 550025,China)

In order to further reduce the residual content of gallic acid in tannic acid,using tannic acid as raw material,by extraction,counter extraction and other separation techniques,the purification technology was optimized using gallic acid residual content in tannic acid as evaluation index. Finally the optimum technology conditions were obtained as sodium phosphates(pH6.8)as stripping agent,tannic acid to ethyl acetate ratio 1∶5(g∶ml) and tannic acid to strippingagentratio 1:2.5(g:ml).Under the conditions,the residualcontentofgallic acid in tannic acid could decrease to lessthan 1%.

gallic acid;high-purity tannic acid;extraction;counter extraction;purification and optimization

TQ941

0254-5071（2017）03-0156-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.031

2016-12-20

贵州省重大专项黔科合重大专项字（20126003）

荆才（1990-），男，硕士研究生，研究方向为发酵工程。

*通讯作者：胡鹏刚（1964-），男，教授，本科，研究方向为现代食品发酵工程专业技术应用与现代生物物质分离科学技术应用。