云南地区滇黄精中黄精多糖的提取及其含量的测定

黄竹珺，李茜，陈丹，樊竹青，罗银玲，郑琰*

（1.普洱学院 生物与化学学院，云南普洱 665000；2.云南省高校亚热带药用食用生物资源开发与利用重点实验室，云南普洱 665000）

黄精是一类常用的滋补中药材，在临床上应用较为广泛。其中，黄精多糖在抗氧化、调节免疫力、调血脂、抗肿瘤、抗疲劳等方面均显示出潜在的药用价值[1-4]。滇黄精在黄精品种中的产量及市场份额最大，是一种重要的“云药”品种[5]。然而，随着人们对黄精原料需求量的持续上升，黄精野生资源锐减，云南黄精市场份额从2010 年前的70%左右降至2018 年底的20%左右[6]。因此，对滇黄精中黄精多糖含量进行测定，为发掘传统中药和更好地指导中药材黄精的多糖质量控制指标和标准建立提供理论依据，同时促使云南产区优质黄精得到大规模的开发和利用。

1 材料与方法

1.1 材料

采集玉溪、保山、昆明、普洱、红河、昭通地区等11 个滇黄精样本；无水葡萄糖对照品（100 mg/支），北京莱耀生物科技有限公司。

1.2 试剂与仪器

无水乙醇，AR，天津市风船化学试剂科技有限公司；蒽酮（≥98.0%），AR，国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸，AR，云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司；无水葡萄糖对照品（170604），含量≥99.0%，北京万佳首化生物科技有限公司。

UV-2800A 紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；HH-W420 数显恒温水浴锅，金坛市大地自动仪器厂；DHG-9245A 型鼓风干燥箱，上海慧泰仪器制造有限公司；FA3204B 电子分析天平，上海天美天平仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

准确称取干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，稀释定容于100.00 mL 容量瓶中，制备得到质量浓度为0.331 mg/mL 的葡萄糖对照品溶液。准确移取梯度体积0.10 ～0.60 mL 的葡萄糖对照品溶液分别置于6 支10.00 mL 干燥的具塞刻度试管中，以蒸馏水作为空白对照，分别向各试管加蒸馏水至试管刻度2.00 mL 处，摇匀，先后依次在冰水浴中缓慢滴加0.2%的蒽酮-硫酸溶液8.00 mL，边加边轻轻摇匀至滴完，于恒温水浴锅中保温10 min 发生显色反应，再置冰水浴中冷却10 min，在试验所确定的最佳波长624 nm 处进行吸光度的测定，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 黄精多糖供试液制备方法的筛选

1.3.2.1 黄精多糖供试液的制备

精密称量干燥恒重过3 号筛（50 目）的黄精样品粉末适量于圆底烧瓶中，先后进行两次热回流，第一次为80%乙醇，趁热过滤，残渣用80%热乙醇淋洗3次，过滤后将所得残渣及滤纸一并放入该烧瓶中，加入与乙醇体积相同的蒸馏水，进行第二次热回流，趁热过滤，残渣和烧瓶用热的蒸馏水洗涤4 次，合并滤液，冷却至室温后，转移至容量瓶中，用少量水多次洗涤盛装滤液的抽滤瓶，转移至容量瓶，加水定容，摇匀，即可得黄精多糖供试液。准确量取1.00 mL 黄精多糖供试液于10.00 mL 干燥具塞刻度试管中，根据“1.3.1”进行吸光度的测定，并根据公式（1）计算黄精多糖含量。

式中，C为黄精多糖供试液被稀释后的质量浓度，mg/mL；D为黄精多糖供试液的稀释倍数；V为黄精多糖供试液的体积，mL；m为黄精样品质量，mg。

1.3.2.2 黄精多糖供试液制备方法的正交优化筛选

如表1 所示，以过筛的药材粒度大小、乙醇回流时间、水回流时间设计正交试验方案，确定最佳的黄精多糖供试液制备条件。

表1 正交因素与水平表

1.3.3 滇黄精中黄精多糖的含量测定

根据正交优化试验所确定的最佳制备方法制取黄精多糖供试液，对11 个滇黄精样本进行黄精多糖含量的测定。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

标准曲线回归方程为y=49.776x-0.103（R2=0.999 0），对照品溶液质量浓度在3.31～19.86 μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

2.2 黄精多糖供试液制备方法筛选结果

2.2.1 正交试验结果

如表2 所示，药材粒度（A）、乙醇回流时间（B）以及水回流时间（C）对黄精多糖的质量浓度都有不同程度的影响，3 个因素对黄精多糖质量浓度的影响程度大小依次为B ＞C ＞A。以黄精多糖含量的高低作为参考评价的指标，由此得出黄精多糖供试液最佳制备方法为A1B2C3，即药材粉碎至50 目，乙醇回流时间1.0 h，水回流时间1.5 h。通过9 个试验得到的最佳组合为A1B2C2，需进行验证试验。

表2 正交实验结果（n=3）

2.2.2 验证试验及方法学考察

对最佳制备方法进行验证，测定3 组平行试验，得到A1B2C3制备方法下黄精多糖含量平均值为9.895 6%，高于A1B2C2组合的黄精多糖含量，证明此工艺条件可重复进行。在此工艺条件下，进行了方法学考察，结果表明：精密度试验、稳定性试验、重复性试验的RSD值分别为0.35%、1.46%、1.26%；加标回收率为98.92%，RSD值为1.99%。

2.3 滇黄精中黄精多糖含量测定结果

如表3 所示，测定了云南不同地区11 个滇黄精样本的黄精多糖含量，其中文山马关滇黄精多糖含量最高，普洱思茅港多糖含量最低，范围在7.043 9%～10.317 1%，含量均在7.0%以上，符合《中国药典》中对黄精多糖的含量标准要求[7]。

表3 黄精多糖含量测定结果（n=3）

测定过程中需要注意，蒽酮-硫酸显色剂的配制必须现用现配，并且避免光照[8]。若配制后搁置时间过长会导致所测得数据偏小。除此之外，在配制过程中所用仪器必须干燥；要求在冰水浴条件下加入显色剂，且加入显色剂的速度不能过快，要缓慢滴加。

3 结论

云南省气候条件适宜滇黄精的生长，可在适生区大力发展黄精种植，建立优质黄精种植基地，缓解黄精药材资源紧缺，保护黄精资源，带动地区经济发展。云南不同地区11 个滇黄精样本黄精多糖含量存在差异，含量在7.043 9%～10.317 1%；过3 号筛（50目）、乙醇回流1.0 h、水回流1.5 h 为制备黄精多糖供试液的最佳条件。蒽酮-硫酸分光光度法简单快捷、准确度高、重复性较好，适用于黄精多糖含量的测定。