茯苓多糖对小鼠肠道菌群的影响
2021-09-02杨国伟王树翠杨树林
杨国伟，王树翠，杨树林
（山东第一医科大学（山东省医学科学院）公共卫生与健康管理学院，山东泰安 271016）
茯苓为多孔菌科茯苓属真菌，多寄生在松科植物树根上[1]。茯苓中，多糖含量约为80%，其具有降血糖、抗肿瘤、消炎和增强免疫力等药理功效[2]，是发挥免疫作用的主要物质，能够提高非特异性免疫系统功能，增强小鼠的抗原特异性体液免疫反应[3]，显著增强小鼠腹腔内吞噬细胞活性，提高NK 细胞的自然杀伤能力[4]，同时对正常细胞无毒副作用[5]。
本实验采用水提醇沉法对茯苓多糖进行提取[6]，并以茯苓多糖作为免疫调节剂，以4 ～5 周的小鼠为研究对象，以胸腺指数、脾脏指数、胸腺细胞凋亡率为指标，反映茯苓多糖对小鼠免疫系统的影响；并对实验组和对照组小鼠进行粪便细菌的微生物分类测序与分析，以分析茯苓多糖对免疫系统的影响是否与肠道菌群相关。
1 材料与方法
1.1 实验动物与试剂
济南朋悦实验动物繁育有限公司的4 ～5 周SPF 级昆明雌鼠，平均体重为30 g；安徽省亳州市的破壁茯苓粉；分析纯无水乙醇。
1.2 仪器与设备
AP-01P 真空抽滤机，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；R E-52A 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；BKQ-Z30 高压蒸汽灭菌器，济南巴艾贝斯生物工程有限公司；BCD-215WTPM（E）冰箱，合肥美的电冰箱有限公司；BX53F 荧光显微镜，奥林巴斯工业有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 茯苓多糖水溶液的制备
采用水提醇沉法制备茯苓多糖，方法为：称取一定量的茯苓粉末，按照茯苓与水的重量比1 ∶20，85 ℃水浴加热4 h，采用抽滤机和孔径为0.22 μm的滤膜进行过滤，收集到的滤液浓缩至原体积的1/10，醇沉浓度为80%，静置12 h，过滤获得滤饼后，用80%乙醇洗涤干燥后称重；用去离子水配制成20 mg/mL 茯苓多糖水溶液，4 ℃冰箱保存。
1.3.2 小鼠的分组与动物实验
按随机数字表法将小鼠随机分为实验组9 只和空白组9 只，实验组按照20 mg/mL 茯苓多糖水溶液0.02 mL/g 的计量灌胃，对照组以相同计量的生理盐水灌胃，分别灌胃14 d，其他条件相同且适宜。
1.3.3 体重与粪便采集
用分析天平分别给小鼠称重并做好记录；无菌采集小鼠粪便并保存。
1.3.4 胸腺指数或脾脏指数计算
将处死的小鼠胸腺和脾脏取出，称量并记录脏器重量，胸腺指数或脾脏指数的计算公式为：
1.3.5 凋亡细胞统计
将脏器分别置40 g/L 多聚甲醛固定；水洗；逐级酒精脱水；二甲苯透明，处理30 min；石蜡包埋，3 h；切片，片厚5 ～7 μm；每例标本均取两张切片，并荧光染色计数凋亡细胞。
1.3.6 收集粪便并做细菌的微生物分类测序分析
对小鼠粪便标本进行16S rDNA 基因测序分析。测序部分由上海生工科技有限公司执行，主要测序过程如下。①样品的预处理：取1 张膜将样品剪碎，与裂解液混合，释放DNA。②提取DNA：使用OMEGA试剂盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 的试剂盒提取DNA，并采用琼脂糖凝胶检测DNA 完整性。③第一轮PCR 扩增：利用Qubit 3.0 DNA 检测试剂盒对基因组DNA 精确定量，以确定PCR 反应应加入的DNA量。④第二轮PCR 扩增：引入Illumina 桥式PCR 兼容引物，PCR 结束后，PCR 产物进行琼脂糖电泳检测。⑤DNA 纯化回收：对于细菌和古菌扩增的PCR 产物和正常扩增片段在400 bp 以上的PCR 产物，选用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）处理。⑥定量混合：利用Qubit3.0 DNA 检测试剂盒对回收的DNA 精确定量，按照1 ∶1 的比例等量混合后测序。等量混合时，每个样品DNA 量取10 ng，最终上机测序浓度为20 pmol。⑦上机测序：第二代测序方法检测16S rDNA 序列，并通过软件进行分析。
1.4 统计学方法
采用SPSS 20.0 软件进行数据分析，组间小鼠胸腺指数、脾脏指数、胸腺凋亡细胞数采用T-test 分析；肠道菌群丰度多组间比较采用Welch's T-test 分析。
2 结果与分析
2.1 茯苓多糖的提取
经水提醇沉法提取，每100g 茯苓粉末可获得茯苓粗制多糖0.39 g，多糖整体得率为0.39%。
2.2 小鼠胸腺指数
小鼠胸腺指数和脾脏指数见表1，以T-test 方法进行统计分析，胸腺指数p=0.02 ＜0.05，脾脏指数p=0.93 ＞0.05，实验组与对照组胸腺指数的差异有统计学意义。
表1 小鼠胸腺指数和脾脏指数表
2.3 小鼠胸腺凋亡细胞数
在荧光显微镜400 倍视野下随机选取6 个视野计数凋亡细胞（见图1），计算所有视野凋亡细胞数（见表2）。以T-test 方法进行统计分析，p=0.001 ＜0.05，实验组与对照组胸腺凋亡细胞数的差异有统计学意义。
表2 小鼠胸腺细胞凋亡细胞数表
图1 荧光染色凋亡细胞
2.4 小鼠粪便细菌16S rDNA 微生物分类测序
2.4.1 测序数据
通过对实验组和对照组样本（T6、T8、T9、C4、C5、C6）进行16S rDNA 微生物分类测序、数据质控后，共得到533 069 条优化序列，实验组、对照组分别得到263 055 条优化序列和270 014 条优化序列，见表3。实验组平均长度为424.09 bp，对照组平均长度为424.57 bp。
表3 各样本有效序列数据统计
2.4.2 OTU 聚类分析
根据不同相似水平，对所有序列进行OTU（Operational Taxonomic Units，操作分类单元）划分，97%相似水平下的生物信息统计结果如图2 所示。两组总共有411个OTU，两组所共有的OTU为367个，占总数的89.2%；实验组独有19 个OTU，对照组独有25 个OTU；实验组共有386 个OTU，对照组共有392个OTU。由韦恩图可知，对照组的OTU 个数比实验组略多，即对照组的多样性略大。
图2 物种分布韦恩图
2.4.3 群落结构差异分析
STAMP 差异分析用于比较两组样本之间物种或功能的丰度，通过此分析可获得显著性差异物种或功能以及该物种或功能更趋向何种环境条件下的样本。两组间差异采用Welch's T-test，分析结果显示在已明确分类的细菌中，各级分类层面组间菌群差异无统计学差异，P值均大于0.05。目（Order）层面上的T-test试验的部分结果如图3 和表4。
图3 实验组、对照组两组间Welch's T-test 分析
表4 目（Order）层面上差异性较大的菌属T 检验表
3 讨论
胸腺和脾脏指数是衡量机体免疫功能的重要指标[7]，本研究通过胸腺指数、脾脏指数和凋亡细胞数反应茯苓多糖对小鼠机体免疫的影响。结果表明，实验组小鼠的胸腺指数均显著降低（p=0.02），凋亡细胞数组间差异显著（p=0.001），茯苓多糖可以显著影响小鼠的免疫系统；而两组小鼠脾脏指数差异不显著（p=0.93），说明茯苓多糖对小鼠脾脏的影响甚微。
相关研究发现茯苓多糖对肠道SIgA 分泌具有调节作用[8-9]。含有茯苓多糖成分的四君子汤总多糖口服给药可对抗磷酰胺诱导的小鼠肠黏膜相关淋巴组织损伤，提示多糖可能对肠道黏膜免疫具有改善作用[10]。OTU 聚类分析中，大多菌群为实验组、对照组两组共有，但对照组OTU 总数略多于实验组，表明对照组种群多样性略大于实验组。对菌群物种丰度进行统计以及Welch's T-test 分析可知，门、纲、目、科、属5 级别中，两组小鼠肠道菌群并无明显差异（p＞0.05），未发现小鼠免疫系统通过肠道菌群的调整而受影响的证据。
4 结论
茯苓多糖会显著影响小鼠胸腺细胞的发育过程，但并未发现茯苓多糖对小鼠免疫系统的影响与肠道菌群相关的证据。
