新型荧光尿苷类似物的合成及其性能研究

周郁，谢晨，富莹莹，洪建权，郑昌戈

（江南大学 化学与材料工程学院，江苏无锡 214122）

荧光光谱法具有灵敏度高、成本低、易于检测等优点，被广泛用于研究核酸和生物分子的结构[1]、极性[2]、粘度[3]、pH[4]等高度敏感局部微环境中。因此荧光核苷类似物已成为研究核酸结构、动力学和对其进行识别的重要工具。

荧光核苷类似物通过将共轭基团以最小化结构扰动掺入并融合到碱基中进行修饰，已被用作生物物理和生物技术应用的探针[5]。具有双环碱基结构的荧光胞嘧啶类似物（PyC）近年来因其抗病毒活性和探针特性而广受关注，其保持了稳定的沃森-克里克H 键合面[6]，并扩展了PyC 核的π 共轭结构[7]。通过呋喃[8]、噻吩[9]、嘧啶[10]或苯[11]部分的邻位修饰的PyC 可以获得所需的光物理性质，即光谱的红移。相比于天然核苷，这些合成的荧光核苷类似物通常表现出更强的荧光特性。在PyC 核的邻位修饰的荧光核苷类似物苯、嘧啶和噻吩的量子产率均很高，分别为0.32、0.28 和0.43[12]。因此，对苯环的对位进一步修饰[13]，引入的负电/正电取代基可以增强或减少共轭的贫电子/富电子联芳基体系的极化[14-15]。

尽管依靠分子结构很难预测光物理性质，但改性PyC 的联芳基体系中的推挽相互作用始终对红移吸收，发射最大值和增加的量子产率起重要作用。为了开发各种不干扰的荧光核苷类似物，以5-碘尿嘧啶（1）为原料，经亲核取代反应得到2’，3’，5’-三苯甲酰氧基-5-(4-甲氧基苯基)尿苷（2），再合成5-碘尿苷核糖（3），其与对甲氧基苯硼酸经Suzuki 偶联反应后，得到荧光尿苷类似物4。其合成路线如图1 所示。

图1 荧光核苷类似物（4）的合成路线

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

联硼酸频哪醇酯（98%）、5-碘尿嘧啶（98%）、1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-1-β-D-呋喃核糖（98%），安耐吉化学；其他溶剂均为市售产品，AR，国药集团化学试剂有限公司；所用水为去离子水。

Bruker AVANCE 400 MHz 核磁共振谱仪，瑞士布鲁克拜厄斯宾公司；MALDI SYNAPT MS 型质谱仪，瑞士布鲁克拜厄斯宾公司；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；CARY Eclipse 荧光分光光度计，美国瓦里安技术中国有限公司。

1.2 5-(4-甲氧基苯)尿苷类似物（4）的合成

按照文献[16]中的方法合成对甲氧基苯硼酸，该化合物为白色絮状晶体，产率66.36%；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ 7.76（d，2H），6.88（d，2H），3.76（s, 3H）。

化合物（2）：白色固体，产率45.88 %；1H NMR（400 MHz, DMSO）δ 11.43（s, 1H），8.97（d, 2H），7.96（d, 2H），7.88（s, 1H），7.85（d, 2H），7.69（t,2H），7.63（t, 1H），7.58 ～7.49（m, 3H），7.43（t,2H），6.32（d, 1H），5.87（q, 1H），5.75（m, 1H），4.86（m, 1H），4.71（dd, 1H），4.46（dd, 1H)。

化合物（3）：白色固体，产率80.31%；1H NMR（400 MHz, DMSO）δ 11.67（s, 1H），8.48（s, 1H），5.72（d, 1H），5.40（d, 1H），5.30（t, 1H），5.05（d,1H），4.03（q, 1H），3.98（q, 1H），3.67-3.84（m,1H），3.56（dt, 1H），3.48（dt, 1H)。

化合物（4）：白色粉末，产率50.78%；1H NMR（400 MHz, DMSO）δ 11.68（s, 1H），8.48（s, 1H），7.27（d, 2H），6.93（d, 2H），5.73（s, 1H），5.40（s,1H），5.25（s, 1H），5.06（s, 1H），4.04（s, 1H），4.00（s,1H），3.88（s, 1H），3.75（s, 1H），3.79（s, 1H），3.58（s, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO） δ 161.65,159.99, 150.87, 146.76, 129.58, 120.35, 114.32, 89.36,85.87, 74.17, 70.23, 60.95, 55.38。

2 结果与分析

2.1 极性对光谱性质的影响

2.1.1 化合物4 在极性溶剂中的光谱数据

测试了化合物4 在不同极性溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。紫外检测浓度均为1×10-4mol/L，荧光检测浓度均为5×10-6mol/L。由表1可知，化合物4的最大吸光度与溶剂极性无明显关系。化合物4 的最大吸收波长依次为317 nm、325 nm、331 nm、333 nm、335 nm 和336 nm，最大吸收波长随极性增大发生蓝移。化合物4 的发射峰分别位于425 nm、420 nm、416 nm、414 nm、412 nm 和411 nm，随着溶剂极性的增大，化合物4 的发射峰发生了红移。这是由于甲氧基苯上的氧原子增强了化合物的溶剂化效应，使得化合物与溶剂之间的相互作用更强，因而其激发态更容易被微环境所稳定，导致激发态与基态之间的能极差减小，因此发射峰红移。

表1 化合物4 在不同极性溶剂中的紫外吸收与荧光发射光谱数据

2.1.2 斯托克斯位移与ET(30)之间的线性关系

斯托克斯位移与ET(30)之间的线性关系能体现生物分子对环境变化的敏感度，有助于研究微观环境下生物分子的结构以及性能的表达。根据斯托克斯位移的计算公式：1/λmax-1/λem，得到了化合物4 在相对应溶剂极性的斯托克斯位移值。以溶剂ET(30)值为横坐标，斯托克斯位移为纵坐标，作图2。化合物4 的R2为0.995 23，即化合物4 的斯托克斯位移随着溶剂极性增大而线性增大，说明斯托克斯位移与溶剂ET(30)值有非常高的线性相关性，化合物4 具备对溶剂极性敏感的特性。

图2 溶剂ET(30)值与斯托克斯位移之间的线性关系

2.2 pH 值对光谱性质的影响

2.2.1 紫外光谱数据

由表2 可知，随着溶液pH 的逐渐增大，化合物4的最大吸收波长及吸光系数未发生规律变化，即化合物4 的吸收光谱不受溶液pH 的影响。

表2 化合物4 在不同pH 水溶液中的最大吸收波长及相应的吸光系数

2.2.2 荧光光谱

如表3 所示，化合物4 的发射峰位移未随pH 的变化而发生偏移，但其荧光强度却随pH 的逐渐增大而增强。

表3 4 在不同pH 水溶液中的发射峰及发射峰处的荧光强度

2.3 粘度对光谱性质的影响

2.3.1 紫外光谱数据

由表4 可知，在不同粘度的甲醇溶液中，随溶液粘度的增大，最大吸收波长和相对应的吸光系数ε无明显变化，说明化合物4 的紫外吸收光谱不会受到溶液粘度的影响。

表4 4 在不同粘度溶液中紫外光谱数据

2.3.2 荧光光谱

随着溶液粘度的不断增大，化合物4 的发射峰位移维持在420 nm，发射峰强度如图3 所示，0 ～50 Pa·s 区间，随粘度增大，化合物4 的发射峰强度具有20%左右的增长量；大于50 Pa·s 区间，荧光强度增大趋势减缓，而后趋于稳定。由此可知，溶液粘度的变化引起了化合物4 的荧光强度规律性的变化，故化合物4 对溶液粘度变化具有敏感性。

图3 化合物4 的发射峰强度与溶液粘度的关系

2.4 荧光猝灭

荧光核苷类似物与天然核苷相互作用后产生的荧光猝灭，可衡量修饰后的碱基对核苷影响的大小，符合Stern-Volmer 方程（1）。

图4 所示为化合物4 在不含猝灭剂时的荧光发射光谱。如图5 所示，4 种天然核苷酸的浓度与化合物4 的荧光强度具有较好的线性关系，斜率依次为0.000 89（A）、0.002 07（G）、0.001 30（C）和0.004 35（T），猝灭常数Ksv 依次为0.000 89、0.002 07、0.001 30 和0.004 35，可知胸苷酸对化合物4 的荧光猝灭效果最好。

图4 化合物4 在不含猝灭剂时的荧光发射光谱（c=5 μmol/L）

图5 添加不同猝灭剂时化合物4 的荧光发射光谱（c=5 μmol/L）

天然核苷酸对化合物4 的荧光猝灭常数处于较低数值，说明化合物4对天然核苷酸的抗干扰性能好。即将化合物4 插入寡核苷酸，化合物4 的荧光强度依然能够维持较高的水平，其光物理性质也不会有太大的影响，能达到预期效果。

式中，F0为无猝灭剂时物质的发射强度；F为加入猝灭剂后物质的发射强度；[NMPs]为猝灭剂的浓度；Ksv 为猝灭常数。

3 结论

化合物4 具备非常理想的光物理性质，对溶剂极性、pH 值和粘度都具有一定的敏感性，其斯托克斯位移与相应溶剂ET(30)的线性关系R2值达0.995 23；随着pH 的增大，荧光强度逐渐增强；随着粘度的逐渐增大，荧光强度发生规律性变化。4 种天然核苷酸对化合物4 的荧光强度均没有较大的影响，猝灭常数数值较低，不影响对荧光类似物的检测。故该类化合物可作为敏感性荧光探针，研究核酸微环境的极性、pH 值和粘度的变化。