大肠杆菌噬菌体EW3-f4 的筛选分离及其抑菌作用初探

林阳君，庄梅琳

（泉州医学高等专科学校 药学院，福建泉州 362011）

噬菌体在自然界中是数量庞大的一个生物群体，据文献报道，自然界中噬菌体的总数可达1032个之多[1]。噬菌体是感染细菌的病毒，存在于细菌的各种生存环境中，它们能感染特定种类的细菌，并能在细菌细胞内迅速增殖，最终将细菌杀灭。法国微生物学家D'HERELLE F 在1917 年[2]发现噬菌体后，就将其作为一种天然的抗菌治疗方法在全世界推广，并大范围应用于公共卫生领域[3]在1919 年，噬菌体首次被许可用于人类疾病的治疗[4]，但二战后，抗生素的成功应用使噬菌体治疗的发展陷入了停滞。抗生素在现代医学的广泛应用，使人类的寿命显著延长，细菌感染也得到了有效控制。但同时，抗生素的过度使用也给人类带来了细菌耐药性、毒副作用和畜产品残留的问题，这些都大大削弱了抗生素的医学价值。2020年5 月，世界卫生组织公布了2020 版的全球抗菌药物的耐药性和使用监测系统（GLASS）报告[5]，涵盖了全球66 个国家上万个监测点的数据显示，抗生素耐药的国家数量不断增加，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等在内的越来越多的细菌感染已产生抗药性。

卫生医疗系统正面临来自抗生素耐药性的重大威胁，寻求包括噬菌体在内的抗生素代替物，又成为了研究的热点[6-7]。大量的关于噬菌体治疗的随机临床试验初步表明了噬菌体的安全性和效果[8-12]。据报道[3,13-15]，目前已有一些纯化的噬菌体制剂被安全地用于人类的局部、口服、静脉和体腔治疗。美国食品药物管理局（FDA）已批准食品加工工业使用噬菌体，作为食用肉类和家禽产品等食品的抗菌添加剂[16]。噬菌体和噬菌体亚成分也被喷洒到人类食品[17]和宠物食品[18]上，或用于控制包装食品中的食源性细菌[19]。已有针对食源性致病菌单核李斯特菌的噬菌体商业制剂，可用在乳制品工业和水产养殖中，从而减少抗生素的使用[20]。这些事实表明，噬菌体作为处理细菌污染的生物控制剂，正逐渐被人们所接受。

在本研究中，以大肠杆菌为宿主菌，从生活污水中分离得到的一株烈性大肠杆菌噬菌体，研究其生物学特性，并对其杀菌抑菌能力进行初步分析，为探索该噬菌体作为大肠杆菌污染的生物控制剂的可行性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 水样与宿主菌

污水水样，采样于泉州医学高等专科学校生活区污水；大肠杆菌（Escherichia coli，CMCC 44102），购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与试剂

0.22 μm 无菌微孔滤膜，德国Merck Millipore公 司；Amicon Ultra-15 离 心 超 滤 装 置（15 mL，100 kDa），德国Merck Millipore 公司；GI54DWS 高温高压灭菌锅，美国Zealway 公司；320R 高速冷冻离心机，德国Hettich公司；超低温冰箱，中国海尔公司，H7650 透射电子显微镜，日本Hitachi 公司等。LB 固体培养基、LB 肉汤、琼脂粉等，均购自上海展云化工有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 污水水样处理

将取得的污水水样用定性滤纸进行二次抽滤，去除大部分杂质与颗粒物。得到样品滤液约200 mL 收集于无菌三角瓶中，加入CaCl2至终浓度1 mmol/L，混匀后静置5 h，以提高水样中噬菌体的收率[21]。

1.2.2 噬菌体的富集

在水样中，噬菌体的数量可能较少而不易发现。因此，在筛选水样中是否存在噬菌体时，需要先进行噬菌体的富集培养操作。将“1.2.1”中得到的粗滤液与大肠杆菌的对数期培养液混合后，静置15 min，恒温摇床120 r/min、36 ℃培养过夜。次日将得到的培养液在4 ℃下4 500 r/min 离心20 min，取上层清液，用0.22 μm 的无菌微孔滤膜过滤。滤液再加入新鲜的大肠杆菌对数期培养液，并重复上述操作2 次，最终得到噬菌体的富集滤液。

1.2.3 双层平板法

以双层平板法[22]验证噬菌体的富集液中是否存在噬菌体。将噬菌体富集滤液稀释至适当的稀释倍数，取0.1 mL 稀释液与0.1 mL 的大肠杆菌对数期培养液混合后于36 ℃中保温15 min。再加入融化好的7 mL 半固体LB 培养基中，轻轻混匀，随后迅速倒入提前备好的LB 固体平板上，轻轻晃动平板至半固体培养基均匀平铺于固体平板上。每个稀释度平行做3 个平板。待平板凝固后，36 ℃倒置过夜培养。若次日在双层平板上观察到噬菌斑，则说明水样中存在大肠杆菌噬菌体。

1.2.4 噬菌体的分离纯化

若在双层平板中观察到噬菌斑，则用接种针从其上挑取边缘清晰、透明度高、斑体较大的噬菌斑，接入10 mL LB 液体培养基中，再加入0.1 mL 大肠杆菌对数期培养液，静置15 min 后，36 ℃、120 r/min 摇床过夜培养。次日采用“1.2.3”中的双层平板法继续观察噬菌斑状态，重复上述步骤直至挑选出大小一致、斑体较大的噬菌斑，即为噬菌体的分离纯化。

1.2.5 噬菌体的滴度测定

噬菌体的滴度，即其效价，表示每毫升样品中所有的具有侵染性的噬菌体的个数，又称噬菌斑形成单位数（Plaque Forming Unit，PFU）。将由“1.2.4”中得到的纯化噬菌体原液（以下简称噬原液）稀释至适当倍数，0.1 mL 的梯度稀释液与0.1 mL 的大肠杆菌对数期培养液混合后，采用“1.2.3”中的双层平板法，在次日通过计算平板上的噬菌斑的数量测定噬菌体效价，规定单个平板上噬菌斑的数量在30 ～300 为合理计数范围。

在此研究中，滴度（PFU/mL）按照式（1）计算：

式（1）中，a、b、c 分别为同个稀释梯度的3 个平行平板上的噬菌斑数量，n为噬菌体原液的稀释倍数。

1.2.6 最佳感染复数

感染复数（Multiplicity of Infection，MOI），亦称感染倍数，其是指在感染时，噬菌体个数与细菌细胞数量的比值，也就是平均每一个细菌感染的噬菌体数量。在培养噬菌体的过程中，采用不同的噬菌体与宿主菌的比例，即不同的感染复数，得到的噬菌体的产率大不相同。因此存在一个噬菌体的最佳使用量可以获得最大的裂解效应，即为该噬菌体的最佳感染复数。制备噬菌体原液（1×109PFU/mL）并稀释至适当倍数，与大肠杆菌对数期培养液（细菌细胞浓度约为1×108CFU/mL）按MOI=1 000、100、10、1、0.1、0.01 和0.001 混合。36 ℃、120 r/min 摇床过夜培养。次日，收集培养液置于4 ℃下4 500 r/min 离心15 min后，0.22 μm 无菌滤膜过滤，双层平板测定噬菌体滴度，获得最高滴度的MOI 即为最佳MOI。

1.2.7 噬菌体原液的超滤浓缩

为了在现代电子显微镜的高放大倍数下观察到噬菌体的病毒颗粒，噬菌体悬液的浓度应达到一定的高浓度（约1×1012PFU/mL）[23]。本研究中采用超滤离心装置对噬原液进行超滤浓缩，从而获得高浓度的噬菌体悬液用于电镜形态观察。向经过预清洗的超滤离心装置加入10 mL 的噬菌体原液，置于4 ℃低温冷冻离心机中，使滤膜面板朝上放置装置，5 000 g离心15 min。离心后，立即用200 μL 枪头置于滤膜面板中回收超滤浓缩液，小心左右摇摆着吸取样本，以确保完全回收。噬菌体超滤液保存在1.5 mL 冻存管中，置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.8 噬菌体电子显微镜下的形态观察

参考文献[24]，采用磷钨酸负染色法。取20 μL噬菌体浓缩液（约1×1012PFU/mL）滴加于覆有聚醋酸甲基乙烯酯（Formvar）膜的铜网（300 目）上，自然沉淀15 min 左右，滤纸从边缘吸取多余剩余液体，自然风干，用2%磷钨酸染液（PTA，pH7.0），负染5 min 后吸去多余液体，自然干燥。在加速电压为80 kV 的条件下于透射电子显微镜中观察噬菌体形态，并拍照记录。

1.2.9 固体培养基上杀菌抑菌能力测试

参考药敏试验中的滤纸片法，在LB 平板上，采用倾注法接种大肠杆菌。在已接种且凝固的平板上放入浸泡过噬原液（约1×109PFU/mL）的无菌滤纸片，注意纸片间距。置于36 ℃恒温箱过夜培养，次日观察结果。

1.2.10 液体培养基中杀菌抑菌效果评估

培养获得新鲜噬原液（约1×109PFU/mL）按最佳MOI 与大肠杆菌对数期培养液混合为实验组，并建立无噬菌体的阴性对照管。静置15 min 后，36 ℃、120 r/min 摇床培养12 h。每隔30 min，取4 mL 混合培养液，以灭菌的LB 液体培养基为对照，测其600 nm 处OD 值。平行重复3 次测得其平均值。

2 结果与分析

2.1 噬菌体分离纯化结果及滴度效价

多次取样并进行噬菌体富集操作后，双层平板法验证水样中存在大肠杆菌噬菌体，经分离纯化，得到一株大肠杆菌噬菌体，命名为EW3-f4。噬菌体EW3-f4 的噬菌斑如图1 所示，斑体透明，边缘清晰，大小为0.7 ～1.3 mm。其滴度为1.58×109PFU/mL。

图1 噬菌体EW3-f4 在双层平板上的噬菌斑

2.2 最佳感染复数

以MOI 为横坐标，以噬菌体EW3-f4 相应滴度的对数值为纵坐标作图，得到图2 曲线。如图2 中曲线所示，噬菌体的最佳MOI 值为0.1。

图2 噬菌体EW3-f4 的最佳MOI

2.3 噬菌体形态观察

经超滤浓缩的噬菌体原液的滴度达到了1×1012PFU/mL，用负染色法在透射电子显微镜下观察到噬菌体EW3-f4 的形态如图3 所示。噬菌体EW3-f4有一个中等长度的多面体头部（105 nm×92 nm），其中隐约可见环状的核酸，尾部是一个可收缩的结构，长度约为103 nm，未观察到明显的尾丝结构。根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的第九次报告[25]和文献[26]，该噬菌体的结构与A2 形态类的噬菌体的描述相符合，属于肌尾噬菌体科（Myoviridae）。

图3 噬菌体EW3-f4 在透射电子显微镜下的形态

2.4 固体培养基上抑菌能力测试

培养后未经稀释的噬菌体EW3-f4 原液（1×109PFU/mL），在固体培养基上的抑菌效果如图4 所示，可见明显、清晰的抑菌圈，抑菌圈a、b、c、d 的直径分别为11 mm、9 mm、9 mm、10 mm，平均抑菌圈直径为9.75 mm。

图4 大肠杆菌噬菌体EW3-f4 在固体培养基上的抑菌效果

2.5 液体培养基中抑菌效果评估

噬菌体EW3-f4 在液体培养基中对大肠杆菌的生长抑制情况如图5 所示。在0 ～3 h 之内，含噬菌体的实验组的OD 值与阴性对照组的OD 值数值和趋势相近，而从第3 h 开始，实验组的OD 值开始下降，在7 h 左右达到最低值，随后开始逐渐上升，在12 h时接近但仍然低于对照组的OD 值。结合对实验组培养液的观察，可能是由于液体培养基中细菌细胞碎片的增加使溶液的OD 值增加。

图5 大肠杆菌噬菌体EW3-f4 在液体培养基中的抑菌情况

3 讨论与结论

与噬菌体相比，抗生素是一种只能选择性破坏细菌某些生理过程（如蛋白质或细胞壁合成）的化学物质。噬菌体疗法则直接针对致病菌，用特异性强的噬菌体作为治疗抗菌剂，会大大减少对微生物群体的破坏。关键的是，无论宿主是否对多种抗生素具有耐药性，噬菌体都可以感染并杀死它们。这是因为细菌的抗生素耐药性和其对噬菌体敏感性在很大程度上是无关的[27]，即使是耐药菌对噬菌体的也同样敏感。事实上，2017 年台湾的一项研究发现[28]，耐药的鲍曼不动杆菌比对抗生素敏感的细菌更容易被噬菌体杀死。

本研究以在生活和实验室中较为常见的大肠杆菌为宿主菌，从生活污水中分离纯化得到一株针对大肠杆菌的噬菌体，命名为EW3-f4。从环境中采集的水样中分离噬菌体时，可能会因为噬菌体的数量较少而不易发现。因此在噬菌体分离前期，参考文献[21]方法往污水水样中加入一定浓度的Ca2+，在一定程度上促进噬菌体的吸附和裂解，从而提高噬菌体的收率。经过3 次的富集培养，就可以通过双层平板法，用肉眼观察噬菌斑来验证噬菌体的存在。在本研究中，大肠杆菌噬菌体EW3-f4 是一株烈性噬菌体，在双层平板培养基上形成的噬菌斑体透明，边缘清晰，直径大小为0.7 ～1.3 mm，其过夜培养的滴度为1.58×109PFU/mL，最佳感染复数（MOI）为0.1，较为容易得到高滴度的培养液且有较高的感染效率。为了对噬菌体EW3-f4 进行形态观察，通过超滤法浓缩噬菌体原液，进行透射电镜观察。在电镜照片中可以看到，噬菌体EW3-f4 的形态属于复合对称，有多面体的头部（105 nm×92 nm）和可收缩的尾部（103 nm），属于肌尾噬菌体科（Myoviridae family）的A2 形态类的噬菌体[25-26]。

获得大肠杆菌噬菌体EW3-f4 的基本信息后，对其的杀菌抑菌作用进行了初步探索。噬菌体EW3-f4原液在固体培养基上可以获得明显清晰的抑菌圈，平均直径为9.75 mm。在液体培养基中，以未加入噬菌体的大肠杆菌培养为对照，通过OD 值来观察噬菌体EW3-f4 的抑菌效果，结果表明EW3-f4 从第3 h 开始出现明显的抑菌效果，在7 h 左右，抑菌效果达到峰值，此处OD 值接近0 h 时的OD 值，肉眼观察到此时培养液接近澄清的状态，后期虽然OD 值又逐渐升高，但结合对培养液的观察，可能是由于培养液中大量的细菌碎片所导致的OD 值增加。综上所述，噬菌体EW3-f4 在抑菌作用方面的表现，值得针对其作为大肠杆菌污染的生物控制剂的潜在能力，进行进一步的应用性研究。

噬菌体的遗传多样性、丰富性和普遍性，让噬菌体疗法可以通过不同的方法进行。噬菌体制剂是禁抗、限抗、替抗、无抗的最有潜力的替补，与疫苗和微生态制剂一样，是更具生态特点的“新药物”，它打破了人们因抗生素显著的化学特性而形成对“药物”的思维定势。因此，建立和扩大噬菌体收集，优化快速筛选感染用噬菌体的方法，以及全面了解噬菌体制剂的治疗和应用实践将会非常重要。