抑郁症模型小鼠肠道菌群的微生物生态学研究

张雪，杨树林，邢一凡，张盛帆，李文婧，王宪昊，曲星雯，杨帆

（1.山东第一医科大学（山东省医学科学院） 公共卫生学院，山东泰安 271016；2.山东第一医科大学第二附属医院，山东泰安 271000）

狂躁抑郁双向情感障碍是一种兼有抑郁和狂躁，且常混合、交替反复发作的疾病，有文献报道，肠道菌群可能通过其代谢产物色氨酸对中枢神经系统起调节作用，从而引起宿主精神行为改变,并导致抑郁发生或加重[1]。本研究通过造模建立抑郁模型小鼠，并通过宏基因组测序技术研究抑郁症小鼠与正常对照小鼠肠道菌群的微生物生态学特征，寻找两组小鼠肠道菌群的差异。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选择4 周龄SPF 级雌性小鼠20 只，适应性饲养1 周。

1.2 试剂与仪器

苯甲酸雌二醇注射液（规格：2 mL；4 mg），岑氏，杭州动物药品厂；BSA323S 电子天平，赛多利斯。

1.3 实验方法

1.3.1 分组

将实验小鼠随机分为实验组与对照组，通过金属耳标编号，对照组为1 ～10 号，实验组为11 ～20 号。

1.3.2 操作

体重检测：测定体重前，将电子秤清洁并固定好，轻轻抓取小鼠，不要沾有垫料，将小鼠放在称重盘内，待示数稳定后读数并记录；试验开始后，连续记录9 天。

饮食量检测：每日饲喂实验组和对照组定量、足量鼠粮，第二天称量剩余鼠粮质量，并计算各组的每日食量；记录饮食第2 天后注射雌激素，连续记录9 天。

皮下注射：小鼠背部进针，进行皮下注射。每2天注射一次，每只小鼠每次注射0.05 mL 苯甲酸雌二醇，共注射6 次，为期12 天。

新物体识别测试：将小鼠放在洁净的放有未知物体的饲养笼中，用录像设备记录10 分钟内小鼠与物体的接触情况，并计数接触的次数；通过统计接触次数的差异，分析小鼠学习记忆能力。

粪便采集及送检：在造模前后分别采集实验组和对照组小鼠粪便，直接抓取小鼠，小鼠受刺激自然排便后，将粪便放入无菌EP 管中。将粪便保存在-80 ℃冰箱中，干冰保存送至生工生物工程（上海）股份有限公司，进行16S rDNA 微生物分类测序与粪便菌群分析。

16S rDNA 微生物分类测序与分析：本步骤由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，基本过程包括：样品的预处理；提取DNA；第一轮PCR 扩增；第二轮PCR 扩增；DNA 纯化回收；定量混合；上机测序；软件分析。

1.3.3 统计分析

采用SPSS20.0 软件进行数据分析，组间小鼠学习记忆能力变化采用t-test 分析；肠道菌群丰度多组间比较采用Welch's t-test 分析。

2 结果与分析

2.1 体重

对照组与实验组体重记录数据见表1 和表2，由表1 和表2 数据可知对照组小鼠与实验组小鼠体重在实验过程中均呈增长趋势。

表1 对照组小鼠体重 单位：g

表2 实验组小鼠体重 单位：g

2.2 饮食

对照组与实验组小鼠实验过程中饮食量数据见表3，由表3 数据可得，实验组和对照组饮食量均存在不同程度的波动，实验组小鼠饮食量波动较大，平均值小于对照组。

表3 饲喂1 ～9 天对照组和实验组小鼠饮食量 单位：g

2.3 学习记忆能力变化

新物体识别实验数据采用t-test 进行分析，对照组实验前后学习记忆能力无显著性差异，P值分别为0.103 2（P＞0.05）；实验组小鼠造模前后以及造模后对照组和实验组小鼠新物体识别能力均有显著差异，P值分别为0.004 9 和0.000 1（P＜0.05），说明造模成功（见表4 和表5）。

表4 试验前后对照组小鼠学习记忆能力

表5 造模前后实验组小鼠学习记忆能力

2.4 菌群基因组测序

2.4.1 测序数据

通过对对照组（HC）和实验组（HA）两组共计4个样本（HC2、HC5、HA12 和HA17）进行16S rDNA测序、数据质控后，共得到有效序列377 695 条，对照组和实验组分别得到优化序列197 398 条和180 297 条，对照组平均长度为421.15 bp，实验组平均长度为420.65 bp（见表6）。

表6 各样本有效序列数据统计

2.4.2 OUT 聚类分析

对97%相似水平下的操作单元分类（Operational Taxonomic Unit，OTU）进行生物信息统计分析，结果如图1 所示。实验组和对照组共有566 个OTU，两组共有的OTU 为434，约占OUT 总数的76.7%；实验组独有的OTU 为50，对照组独有的OUT 为82；HA 组共有484个OTU，对照组共有516个OUT。由图1可知，大多菌群为实验组、对照组两组共有，对照组OUT总数略多于实验组，即对照组种群多样性略大于实验组。

图1 样本OUT 分布韦恩图

2.4.3 Alpha 指数分析

在OTU 的基础上，通过计算Shannon 指数、Chao 指数、Ace 指数以及Simpson 指数分析单个样品的多样性。样品的多样性可分为物种丰度和物种均匀度，若前面三项指数越大，最后一项指数越小，则表明样品中的多样性越丰富。样本HA12、HA17、HC2 和HC5 的Alpha 多样性统计结果如表7 所示。

由 表7 可 知，Shannon、Chao 和Ace 指 数 中对照组的两样本数值均比实验组组要高，最后一项Simpson 指标对照组数值比实验组要低，说明对照组物种多样性整体大于实验组。

表7 Alpha 多样性统计结果

2.4.4 稀释曲线分析

稀释曲线是从样本中随机抽取一定数量的序列，统计这些序列对应样Alpha 多样性指数，以抽取的数据量为横轴，以Alpha多样性指数值为纵轴绘制曲线，根据曲线是否达到平缓或达到平台期来判断本次测序数据量是否足够。

对照组和实验组Alpha 指数对应的稀释曲线如图2 和图3 所示。由图2 和图3 可知，指数稀释性曲线指向一致且趋向平坦，证明本次测序数据量足够。

图2 HC 组Alpha 指数稀释曲线

图3 HA 组Alpha 指数稀释曲线

2.4.5 群落结构差异分析

2.4.5.1 物种相对丰度图

采用Welch's t-test 分析方法，分析样本在不同分类水平上的群落结构。将多个样本的群落结构分析放在一起对比，使用较直观的柱状图显示，并将在所有样本中丰度占比均小于1%的物种归为others，其余的作为优势物种进行分析。

对照组与实验组基于门（Phylum）和属（Genus）分类水平的结果如图4 和图5 所示。由图4 可知，在门水平，HC、HA 两组样品的优势菌落可分为5 大类：厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）和放线菌门（Actinobacteria）。其中，厚壁菌门和拟杆菌门在两组样品中占绝大多数，且在HA 组中拟杆菌门含量大于HC 组，厚壁菌门含量少于HC 组。

图4 门水平的分析柱状图

由图5 可知，在属水平，HC、HA 两组样品的优势菌落可分为22 个属。对照组占比前5 位的菌属分别是乳酸杆菌属（Lactobacillus）、别普雷沃菌属（Alloprevotella）、阿利斯蒂普斯属（Alistipes）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）和螺杆菌属（Helicobacter）；实验组占比前5 位的菌属分别是乳酸杆菌属（Lactobacillus）、巴内西埃拉属（Barnesiella）、土杆菌属（Turicibacter）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）和类杆菌属（Bacteroides）。

图5 属水平的分析柱状图

2.4.5.2 Welch's t-test 分析

STAMP 差异分析用于比较两组样本之间物种或功能的丰度，通过此分析可获得显著性差异物种或功能以及该物种或功能更趋向何种环境条件下的样本。当比较对象为组时，采用Welch's t-test，结果如图6所示。由图6 可知，g_unclassified_Enterobacteriaceae和g_Roseburia 两个属在对照组、实验组两组间有显著性差异，P值分别为0.023 和0.004（P＜0.05）。

图6 Welch's t-test 分析

3 讨论

近年来，随着当代社会竞争压力逐年上升，抑郁症的发病率也随之上升[2]，因此抑郁症的相关发病及其防治机制的研究已经成为艰巨且紧迫的任务。抑郁病人大多数存在食欲下降和体重减轻的躯体症状，也会出现记忆力下降、兴致低迷以及认知功能障碍等变化[3]，因此当小鼠被给予外源性雌激素时，可造成小鼠体内高雌激素状态，从而出现行为学和神经递质5-HT 的异常变化[4]。本实验通过注射苯甲酸雌二醇使小鼠体内形成高雌激素的病理状态，小鼠会在体重、体温、饮食等生理状态以及学习能力等行为学方面表现出组内和组间的变化[5-6]。对造模成功的小鼠抑郁模型进行粪便取样，通过宏基因组测序探究抑郁小鼠与对照组之间菌群生态学的异同。

实验结果表明，当雌性小鼠长期处于高雌激素的病理状态下，会出现体重增长变慢、食欲降低以及学习记忆能力减退等抑郁样表现。根据OUT 聚类分析，大多菌群为HA、HC 两组共有，但HC 组OUT 总数略多于HA 组，表明HC 组种群多样性略大于HA 组；Alpha 指数分析结果也说明HC 组物种多样性整体大于HA 组；对菌群物种丰度进行统计以及Welch's t-test 分析可知，g_unclassified_Enterobacteriaceae 和g_Roseburia 两个属在HC、HA 两组间有显著差异（P＜0.05）。

当人体出现腹泻时，肠杆菌属（Enterobacteriaceae）在粪便菌群测定中高于正常菌群，同时测定5-HT 含量也高于正常菌群[7]，因此可对二者的相关性进一步探究。目前已有研究针对“脑-肠-微生物”轴影响大脑神经的机制进行研究，并发现将普通小鼠的粪便移植于无菌小鼠后，其中枢5-HT 代谢异常可部分逆转，这些肠道微生物所介导的神经生化改变，与抑郁症患者所伴有的神经递质紊乱、下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA 轴）失调相契合，从分子层面提示肠道微生物紊乱可能与抑郁发生相关[8]。在溃疡性结肠炎治疗的相关研究中，丁酸生成细菌（Roseburia intestinalis，R.I）鞭毛蛋白起到了一定的抗炎作用[9]，说明抑郁症相关菌属在炎症性肠病中也有着至关重要的作用，可为抑郁症及其并发肠道疾病的药物研发以及疗效监测提供相关思路。

4 结论

小鼠长期处于高雌激素的病理状态下会导致抑郁症的发生，抑郁小鼠肠道菌群多样性小于正常小鼠，其丰度在界、门、纲、目、科这些层面上表现出统一性，而在菌属层面上（g_unclassified_Enterobacteriaceae 和g_Roseburia）差异性明显。