四川规模兔场球虫病流行病学调查

叶勇刚，任永军，于吉峰，魏 勇，叶建强，肖 璐，曹 冶，谢 晶，李兴玉，潘 梦，林 毅，张先惠，康润敏

（四川省畜牧科学研究院 动物遗传育种四川省重点实验室，成都 610066）

兔球虫病是家兔最常见也是对家兔危害最为严重的一种寄生虫病，主要分为肠球虫病和肝球虫病。其中肠球虫病主要由肠道球虫如已公认的穿孔艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、大型艾美耳球虫、梨形艾美耳球虫、无残艾美耳球虫、盲肠艾美耳球虫、肠艾美耳球虫、小型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫和维氏艾美耳球虫感染引起；肝球虫病主要由斯氏艾美耳球虫感染引起[1-2]。不同种类的球虫其致病力差异较大，其中斯氏艾美耳球虫致病力最强[3-5]。

目前，生产上对兔球虫病的防控主要依靠药物预防为主，在饲料或饮水中添加抗球虫药物是预防兔球虫病的有效方法。在抗球虫病方面，除妊娠期外，在规模化兔场兔的其他生长阶段均会连续使用添加抗球虫药物的饲料，在长期药物选择下，即便不停更换药物种类，耐药虫株也会不断出现。四川是我国养兔第一大省[6]，随着近年来养兔产业的不断发展，规模化养殖程度不断提高，规模兔场数量逐步增多[7]；高设施化、现代化养殖条件虽然提高了生产效益，但却并未减少球虫病的发生。此外，四川近10年来鲜有兔球虫病流行病学报告，仅见郝桂英[8]对四川西昌市郊兔球虫感染情况调查和Yin等[9]对四川不同地区110份粪样的调查。基于此，开展四川规模兔场球虫病流行病学调查十分必要，可为四川省科学防治兔球虫病提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂2×Taq PCR Master Mix和粪便基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；D2000 Plus DNA Ladder购自北京索莱宝科技有限公司；饱和食盐水溶液和2.5%重铬酸钾溶液由本实验室配制。参照文献[10]合成11种兔艾美耳球虫鉴定引物，由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

1.2 粪样的采集在四川东部（遂宁市、简阳市）、南部（自贡市、眉山市）、西部（雅安市）、北部（绵阳市、巴中市）、中部（成都周边的大邑县、金堂县）五个大区域，选择15个存栏数量大于1000的规模化养兔场（每个区域选择3个兔场），分别采集1～3月龄、3～6月龄和6月龄以上三个年龄段兔新鲜粪样450份。每份粪样不低于20 g，单独存放于透明塑料采样袋中做好标记，置于装有冰袋的泡沫箱中带回实验室镜检。

1.3 卵囊定量检查每克粪便卵囊数（Oocysts per gram，OPG）采用麦氏法进行检测[11]。

1.4 卵囊的收集以每个养殖场为单位，将30份定量检测后剩余的粪样混合，研磨碾碎后加入适量水混匀，用80目滤网过滤2次，滤液4000 ×g 离心5 min，沉淀加入饱和食盐水混匀放置1 min后过滤，滤液2000 ×g离心5 min，取上清液加入5倍体积水混合后，5000 ×g离心8 min，小心弃掉上清液，沉淀即为收集的卵囊。

1.5 卵囊的形态鉴定取适量卵囊于2.5%重铬酸钾溶液中孵化（温度为28℃），每天在显微镜下观察卵囊孢子化情况，根据孢子化卵囊颜色、有无内外残体、有无卵膜孔等，参照图谱和国内外相关文献资料进行虫种鉴定。

1.6 卵囊的分子鉴定将上述卵囊置于冻存管中（卵囊浓度大于1×105个/mL），经-80℃和室温反复冻融5次后，提取总DNA。PCR反应条件为：95℃预变性4 min；95℃变性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃延伸7 min。反应结束后，取10 μL反应液用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与讨论

2.1 球虫鉴定结果球虫种类的鉴定，多采用形态学方法鉴定，主要将球虫卵囊孢子化后，依据卵囊颜色、形状、尺寸、有无卵膜孔、有无内外残体、孢子化时间等形态特征进行辨别，此法简单、直观，但却耗费时间，同时也需要观察者掌握必要的形态学知识和相关经验。Oliveira等[10]建立了针对11种兔球虫鉴别诊断的PCR方法，很好的补充了形态学鉴定方法的不足。本研究将二者结合并用于兔球虫种类鉴定，结果表明四川规模化兔场感染球虫9种，分别为巨型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫、无残艾美耳球虫、斯氏艾美耳球虫、盲肠艾美耳球虫、梨形艾美耳球虫和小型艾美耳球虫。除小型艾美耳球虫外，其余8种均已出现在近5年的四川兔球虫流病调查文献中[9]。肠艾美耳球虫在此次调查中未被检出，或许与养殖方式、采集区域或覆盖养殖场数量不够大有关。9种孢子化球虫卵囊见图1；不同种球虫PCR扩增条带大小与文献一致[10]，结果见图2。巨型艾美耳球虫：卵囊呈卵圆形，淡黄色，卵膜孔明显，呈堤状突出于卵囊壁外，卵囊内有外残体，孢子囊内有内残体，长35.51 μm ± 5.56 μm，宽25.39 μm± 3.42 μm，具体见图1A。中型艾美耳球虫：卵囊呈长圆形，玫瑰橙黄，有卵膜孔，卵囊内有外残体，孢子囊内有内残体，长27.36 μm ± 4.45 μm，宽16.24 μm ± 6.02 μm，具体见图1B。黄艾美耳球虫：卵囊呈卵圆形，黄色，在宽一段有明显的卵膜孔，卵囊内无外残体，孢子囊内有内残体，长30.48 μm ± 3.64 μm，宽19.12 μm ± 4.57μm，具体见图1C。穿孔艾美耳球虫：卵囊小呈椭圆形，无色或淡绿色，无卵膜孔，卵囊内有外残体，孢子囊内有内残体，长23.36 μm ± 6.12 μm，宽14.83 μm± 3.56 μm，具体见图1D。无残艾美耳球虫：卵囊呈卵圆形，淡黄色，有卵膜孔，卵囊内无外残体，孢子囊内有内残体，长32.46 μm ± 3.12 μm，宽22.76 μm ± 1.95μm，具体见图1E。斯氏艾美耳球虫：卵囊呈长卵圆形，淡黄色或无色，有卵膜孔，卵囊内无外残体，孢子囊内有内残体，长36.12 μm ± 3.14 μm，宽20.63 μm ± 1.37 μm，具体见图1F。盲肠艾美耳球虫：卵囊呈长圆形，淡黄色或无色，有明显卵膜孔，卵囊内有外残体，孢子囊内有内残体，长33.22 μm ± 6.04 μm，宽18.40 μm ± 2.56 μm，具体见图1G。梨形艾美耳球虫：卵囊呈梨形，淡黄色，有卵膜孔，卵囊内无外残体，孢子囊内有内残体，长28.96 μm± 2.18 μm，宽18.64 μm ± 2.18 μm，具体见图1H。小型艾美耳球虫：卵囊呈圆形，无色，卵膜孔不明显，卵囊内无外残体，孢子囊内无内残体，长11.76 μm ± 1.24 μm，宽10.78 μm ± 0.21 μm，具体见图1I。

图2 9种兔球虫特异性PCR鉴定结果Fig.2 The PCR identification results of 9 species of rabbit coccidium

2.2 不同地区不同年龄段兔球虫感染率及感染程度对采自各地区不同日龄兔的450份粪样进行球虫卵囊检测。结果显示，1～3月龄幼兔球虫感染率达96%，其中东、南、西、北和中部地区幼兔球虫感染率分别为96.67%，96.67%、96.67%、96.67%和93.33%；4～6月龄兔球虫感染率为77.33%，其中东、南、西、北和中部地区兔球虫感染率分别为76.67%、80%、76.67%、80%、73.33%；6月龄以上兔球虫感染率为40.00%，其中东、南、西、北和中部地区兔球虫感染率分别为40%、46.67%、36.67%、43.33%、33.33%。1～3月龄幼兔球虫感染程度最高，平均OPG值为14 913；其次为4～6月龄，平均OPG值为4320；6月龄以上兔球虫感染程度最低，OPG值为716；具体结果详见表1。本次对兔球虫病的调查涉及四川8个市区，15个规模养兔场，兔球虫总感染率达71.11%，Yin等[9]（2016）报道四川兔球虫感染率56.4%、邢勇等[12]（2017）报道的内蒙古包头固阳县兔球虫感染率25.33%，Jing等[13]（2012）报道的中国西南地区兔球虫感染率62.5%；低于姜英等[14]（2013）报道的河南兔球虫感染率74.6%、简永利等[15]（2014）报道的浙江温州地区兔球虫感染率77.1%、王晔娥等[16]（2017）报道的陕西榆林獭兔球虫感染率100%，陈仁锋等[17]（2015）报道的福建郊区肉兔球虫感染率85.86%。其中1～3月龄幼兔球虫感染率在各年龄组中最高，与以上所有调查报告一致。

表1 不同地区不同年龄段兔球虫感染率及感染程度Table 1 Infection rate and intensity of coccidiosis in different age groups in different regions

2.3 不同兔场流行的球虫种类对不同地区各养兔场检出的球虫进行种类鉴定，结果显示，在15个规模养兔场中，球虫感染均为混合感染，每个养殖场检出4～7种球虫。从各个兔场感染的球虫种类来看，四川省规模兔场感染的球虫优势种为巨型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫和黄艾美耳球虫，场阳性率超过90%，其次为穿孔艾美耳球虫、无残艾美耳球虫、斯氏艾美耳球虫、盲肠艾美耳球虫、梨形艾美耳球虫和小型艾美耳球虫，详见表2。其中巨型艾美耳球虫和中型艾美耳球虫在最近已报道的四川兔球虫流行种类中，流行率排在第2和第4位[9]。

表2 15个养殖场感染的兔球虫种类Table 2 Rabbit coccidial species detected in fifteen farms

四川是中国养兔第一大省，兔年出栏量占全国总出栏量的43.75%。兔的生产模式主要有集约化的规模生产模式、合作组生产模式和庭院生产模式，就全国而言，规模兔场家兔出栏量已占总出栏量一半以上[6]。近年来，四川随着养兔产业的调整升级，规模化兔场数量也日益增加。尽管规模化兔场饲养条件高于合作社和庭院养殖场，但由于其四季繁殖加之兔舍多有增温和保温措施，在给兔带来舒适性的同时，也为球虫卵囊的发育创造了条件[7,18]。此外，调查的15个养兔场几乎都使用添加抗球虫药物如氯苯胍、氯羟吡啶等商品全价料，该法早期虽能有效遏制球虫病，但随着时间的推移和不重视定期科学更换抗球虫药物，造成多数养殖场用常规添加药物剂量的饲料不能有效控制球虫病。这也是本次调查发现规模养兔场球虫感染率和感染程度较高的原因。

综上所述，四川规模兔场球虫感染阳性率为71.11%。主要流行9种球虫，其中巨型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫和黄艾美耳球虫场阳性率最高，为优势虫种。1～3月龄幼兔球虫感染率和感染程度最高，普遍为中度感染，是防控的重点。