Viperin介导细胞抗病毒效应研究进展

余影影，钟自富，朱启运，徐 帅

（中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046）

先天性免疫（innate immunity），也叫做天然免疫或非特异性免疫，是免疫系统中的第一道防线，在非特异性抵抗外来病原微生物的入侵、复制等过程中起着十分关键的作用[1]。Viperin（virus inhibitory protein,endoplasmic reticulum-associated,interferon）是一种具有高效广谱的抗病毒效应、与内质网密切相关且受干扰素（interferon，IFN）诱导的蛋白分子，具有调节细 胞代谢、调控细胞信号转导、参与IFN表达等多种生物学功能。除了IFN能够诱导Viperin表达外，它还受大多数DNA、RNA病毒以及革兰氏阴性菌的脂多糖成分（lipopolysaccharide，LPS）感染或刺激后而活化表达[1-2]。Viperin最初定义是虹鳟鱼被弹状病毒感染后可导致出血性败血症，而虹鳟鱼白细胞在感染后有特定基因被诱导表达，该基因被称为病毒诱导基因（virus induced gene，vig），而Chin等[3]在研究人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）时发现：机体受HCMV诱导产生IFN的刺激基因cig5（cytomegalovirus-induced gene 5），并且发现在IFN-γ和巨噬细胞的相互作用中IFN-γ诱导巨噬细胞产生的基因和cig5序列完全一致，将该基因命名为Viperin。同时，他们还发现Viperin基因编码的氨基酸序列与小鼠成骨细胞成熟分化表达时期受IFN诱导表达的蛋白氨基酸序列具有同源性[4]。Viperin基因作为IFN刺激基因（interferon-stimulated genes，ISG），正常情况下在宿主体内表达的量非常低，而IFN可以诱导Viperin表达，Ⅰ型IFN对Viperin的激活诱导效应远远大于IFN-γ[2,4]。Viperin在鱼类、鸟类、爬行动物以及各种哺乳动物中广泛存在，且Viperin基因在遗传进化上高度保守[5-6]。在Viperin蛋白的一级结构中包含CxxxCxxC特殊基团，该基团属于SAM（S-adenosyl-L-methionine）家族成员的特征并且是其结合铁硫蛋白的催化基团，因此又将Viperin称为RSAD2（radical SAM domain-containing 2）[2,4,7]。近年来，随着分子生物学技术的发展，使Viperin从抗病毒蛋白重新定位到参与细胞信号转导的信号分子的重要角色，但其抵抗病毒的具体机制仍不清楚，因而探究Viperin抗病毒机制成为了研究热点，其在先天免疫上的应用前景备受关注。

1 Viperin蛋白结构

人的Viperin蛋白（图1）由361个氨基酸构成，其分子量约为42 kDa，一级结构具有三个不同的区域：一个N末端（长度和序列随物种异同而可变），一个中央保守区域，以及一个高度保守的C末端[2,4,7]。Viperin三级结构为同时含有α螺旋和β片层的双层结构[7]。一级结构中氨基酸序列N端含有亮氨酸拉链和双亲性的α螺旋结构，使Viperin以二聚体的形式聚集、附着在内质网（endoplasmic reticulum，ER）胞质侧，这对Viperin蛋白的正确定位和发挥抗病毒作用至关重要[4,7]。Viperin与其他蛋白质的相互作用很大程度上依赖于N端[8]；中央保守区域包含了4个高度保守的基序（M1～M4），其中M1中含有的CxxxCxxC结构域。Duchene等[9]证明了Viperin在体外可以使SAM解离并产生5'端的脱氧腺苷化，因而证明了Viperin是依赖SAM激酶家族成员。CxxxCxxC结构可与铁硫蛋白（4Fe-4S）相结合，结合后的铁硫蛋白可氧化脱氧腺苷酸从而进一步调控一系列的反应[4]。C末端对于Viperin与CTP的结合是必需的，且Viperin可通过C末端部分氨基酸的缺失或替换影响其表达水平从而影响其抗病毒能力[10-11]。

图1 人Viperin蛋白结构模式图Fig.1 The primary structure of human Viperin

2 Viperin蛋白功能

2.1 参与抗病毒反应宿主细胞受到外来病原微生物入侵后，可以通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别和探测病原并产生IFN和细胞因子等[12-13]。IFN可以通过两条途径产生抗病毒应答：一是通过早期识别病原后，产生少量的IFN；二是通过后期的IFN信号转导过程，在Ⅰ型IFN和IFNAR（interferon alpha receptor）结合后可激活JAK-STAT信号通路，进而激活上百种的ISGs表达，其中就包含Viperin[13]。Viperin作为先天性免疫的重要信号分子，能够通过多种途径参与细胞信号转导。已证实能够参与介导STING-TBK1信号轴、Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）和RIG-I样受体（retinoic acid-inducible gene I-like helicases receptors，RLRs）信号通路等[12,14-15]。

Viperin可通过多种方式发挥抗病毒作用，主要有以下几种：参与调控宿主抗病毒天然免疫；影响病毒成分的合成；通过调控细胞代谢影响病毒的生命周期；还可与病毒蛋白相互作用产生抗病毒效应等。但大多数生物Viperin抗病毒效应的具体机制仍然不明确。

2.2 调控细胞代谢Viperin双亲性的α螺旋结构使Viperin主要定位在ER上，聚集在ER的Viperin可调节胆固醇、类异戊二烯生物合成和脂筏的形成以及脂肪滴的组成。Viperin能与法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）结合并降低其表达水平，从而抑制胆固醇的合成[16]。Viperin还可以与线粒体三功能性蛋白（trifunctional protein，TFP）的β亚基（HADHB）结合抑制HADHB的硫解酶活性，参与调控细胞脂肪酸的β氧化过程[16]。Viperin与HADHB结合也可促进HADHB从线粒体逆转运出并通过蛋白酶体途径降解，这为Viperin降低HADHB活性提供了另一种机制[17]。Rezasoltani等[18]发现Viperin可催化解旋酶如RIG-I等发生甲硫氨酸氧化，增加其表达和先天免疫的信号传导活性。此外，Viperin可通过其自由基SAM活性消耗细胞的核苷酸库以干扰线粒体代谢[19]。

2.3 参与调节体温固有表达的Viperin是调节脂肪组织生热作用的关键调节剂，表明Viperin有作为在临床中进行温度调节分子靶标的潜力。高脂饮食（HFD）刺激下或暴露于寒冷环境中，Viperin表达会增加，在脂肪组织的生热激活作用中发挥抑制作用。Viperin缺乏症会上调与热生成和脂肪酸β-氧化相关的基因的表达，从而增加热量产生，减少脂肪量，改善高脂饮食诱导的葡萄糖耐量，并增强耐寒性。在病毒或细菌感染时，Viperin表达的增加可在发热反应中发挥抑制作用。相反，Viperin表达的增加也可能在某些病原体（如埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒和黄热病病毒）导致的致死性发热反应中起保护作用[20]。

2.4 影响蛋白分泌一项早期的研究发现，Viperin的过表达抑制了可溶性蛋白的分泌，而Viperin的N端似乎在其中发挥着作用，推测其N端α螺旋可能会引起内质网形态改变，进而抑制蛋白质分泌[21]。另一项研究表明，Viperin在分化软骨细胞中可以调节可溶性蛋白以及细胞因子CXCL10的分泌[22]。另外，Viperin缺乏症可促进巨噬细胞的活化和M1、M2细胞因子的分泌，Viperin在M1和M2巨噬细胞表型的确定中也起着重要调节作用[23]。

3 抗病毒机制

3.1 ddhCTP作为链终止剂直接抑制病毒复制Viperin的发现与鉴定已过去了20余年，但其催化活性直到近些年才得以解析。Viperin可催化CTP形成ddhCTP（3'-deoxy-3',4'-didehydro-CTP），ddhCTP可作为核苷酸类似物被病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）识别并加入到新合成的RNA链中，但由于ddhCTP缺乏3'-羟基，不支持RNA模板进一步延伸，因此可作为RNA链终止剂，发挥抗病毒作用。Viperin是人体内鉴定的可直接产生病毒复制抑制剂的第一个蛋白[24]。Viperin也可催化UTP形成ddhUTP，但其与UTP的结合效率很低。Viperin通过催化形成ddhCTP进而发挥抗病毒作用已在诸多病毒中得到验证，例如HCV、DENV、WNV、ZIKV等[24]。

3.2 Viperin与天然免疫分子直接相互作用在宿主的天然免疫因子中，IFN和细胞因子是抗感染的重要介质，其中ISGs起着枢纽作用。Viperin可参与NF-кB和AP-1介导的信号通路来调控T细胞与T细胞受体激活过程[25]。在树突状细胞中，Viperin通过参与并调节TLR7和TLR9-IRAK1信号系统促进Ⅰ型IFN的大量表达，进而产生强烈的抗病毒效应[12-13]。

Viperin可通过招募髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、白介素-1受体相关激酶1（interleukin-1 receptor-associated kinase1，IRAK-1）、IRAK-4、肿瘤坏死因子受体相关因子3（TNF receptor-associated factor 3，TRAF3）和TRAF6等信号蛋白至内体激活NF-кB和IRF7，NF-кB可以将信号转导至细胞核内并调控炎性因子表达。Viperin也可通过招募信号蛋白MyD88至内体激活IRF7来调控产生Ⅰ型IFN，IFN分泌出细胞后可以与相应的干扰素受体（typeⅠinterferon receptor IFNAR）结合后激活JAK-STAT信号通路，活化的STAT蛋白再次调控细胞核内Viperin等ISGs基因的表达，表达出的Viperin蛋白可进一步激活Ⅰ型IFN的表达[12-13]。

有研究发现，Viperin与先天免疫dsDNA信号传导途径的关键信号分子STING和TBK1共定位，并直接与STING结合诱导TBK1增强其K63型多聚泛素化，但负责将K63型多聚泛素链与TBK1连接的E3连接酶仍然未知。然而，在dsDNA刺激后，E3连接酶TRAF3和TRAF6与Viperin共定位，且TLR7和TLR9被激活，从而促进Ⅰ型IFN的大量表达，产生强烈的抗病毒效应。虽然，TRAF3和TRAF6之前已被证明与STING-TBK1信号轴有关[26-27]，但是，需要进一步确定这种共定位与Viperin的TBK1活化作用的功能相关性[14]。

3.3 Viperin可通过调控细胞代谢影响病毒复制脂筏是一种富含胆固醇和鞘磷脂的膜结构，与HCV等病毒的侵入、复制、包装，以及转运过程密切相关Viperin双亲性的α螺旋结构使Viperin主要定位在ER上，聚集在ER的Viperin可调节胆固醇、类异戊二烯生物合成、脂筏以及脂肪滴的组成，从而对多种DNA和RNA病毒的复制、成熟、释放等过程产生抑制作用[3,28]。Viperin能与FPPS结合并下调其表达，FPPS可催化香叶基焦磷酸和异戊烯基焦磷酸形成法呢基焦磷酸（FPP）[16]，FPP是类异戊二烯和胆固醇生物合成中的关键中间体。因此Viperin可通过抑制FPPS来抑制胆固醇的产生，从而抑制病毒的释放过程[29]；HCV、西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）等黄病毒科病毒的复制过程依赖于ER表面的脂质，Viperin可通过破坏细胞内脂筏的合成来抑制该类病毒的复制过程[2]。

Viperin可以靶向线粒体，与线粒体三功能复合物的β亚基（HADHB）结合抑制HADHB的硫解酶活性。但HADHB会激活Viperin，导致ddhCTP的合成，从而起到抗病毒作用。同时Viperin靶向线粒体还提高了HADHB从线粒体逆转运并降解的速率[17]。Bai等[18]发现Viperin可催化甲硫氨酸氧化以促进蛋白的表达，如Viperin可诱导RNA解旋酶RIG-I的甲硫氨酸氧化，增加RIG-I蛋白的表达和先天免疫的信号传导活性。此外，Viperin可通过其SAM自由基活性消耗细胞的核苷酸库并干扰线粒体代谢来抑制病毒复制[19]。

3.4 与病毒蛋白直接相互作用有研究表明，附着在ER表面上的Viperin能与病毒复制依赖的某些因子作用以抑制病毒的复制，如Viperin可通过干扰NS5A蛋白与宿主蛋白hVAP-33的结合而抑制HCV复制[30]。Viperin可与CSFV的E2蛋白相互作用抑制病毒在体外的复制[31]，而Viperin的SAM和N末端结构域可以与CSFV的NS5A直接互作抑制病毒在细胞中的复制[32]。Viperin通过靶向ZIKV和TBEV的NS3蛋白进行蛋白酶体降解，从而限制ZIKV和TBEV的复制[33]。此外，猴Viperin（mViperin）可与猪繁殖与呼吸综合征病毒的N蛋白互作，通过阻断PRRSV进入的早期步骤以及基因组复制和翻译来抑制PRRSV的复制[34]；鸡Viperin通过与新城疫病毒的基质蛋白相互作用抑制NDV的体外感染[35]。

Viperin通过与GBF1互作诱导非感染性病毒颗粒的分泌来调节黄病毒的毒力。GBF1的水平升高抑制了Viperin的抗病毒活性以及C颗粒的释放。GBF1是Viperin的新型相互作用伴侣，DENV、HCV、A型流感病毒和基孔肯雅病毒等大多数病毒都在其生命周期中与Viperin蛋白有相互作用[36]。

实际上，Viperin在发挥抗病毒作用的过程中多是以上几种方式的共同作用，如1型单纯疱疹病毒的糖蛋白D（gD）可与Viperin互作，通过提高IRF7介导的IFN-β活性增强Viperin的抗病毒能力[37]；Viperin既可通过破坏脂筏的形成，也可以在定位于ER后与VAP及HCV的NS5A蛋白互作，通过蛋白酶体降解途径促进NS5A降解而发挥抗病毒作用[38]。

4 结语与展望

自2001年研究发现Viperin是一种抗HCMV的IFN诱导蛋白，Viperin的研究引起了广泛的关注，但对Viperin研究仍需进一步推进。Viperin除了能被多种病毒和病毒核酸刺激、诱导而表达，还受非病毒性微生物的细菌LPS成分诱导表达，这意味着Viperin可能具有更广泛的抵抗外来病原微生物的作用。因此，将来对Viperin的深入研究可能会发现其更多未知的生物学功能和免疫学作用，会在天然免疫系统中将Viperin的角色进行重新定位。虽然人、小鼠等少数哺乳动物以及多种鱼类的Viperin的基因序列等信息已被公布，但仍有许多其它物种的Viperin基因序列、蛋白结构尚待定义，将来Viperin的研究对象会涉及更多的物种，其抗病毒效应将被进一步的丰富和扩充。对Viperin的深入研究不仅有助于解答Viperin为何存在多种抗病毒机制来抵抗不同病毒，而且为以Viperin为基础的新药物、新疫苗等生物制品开发提供了广阔的前景。