我国部分地区猪养殖场耐药基因mcr-1阳性大肠杆菌的PFGE和RAPD分型对比研究

仝慧娴，姚晓慧，王舒丰，魏建超，刘 珂，邵东华，邱亚峰，马志永，李蓓蓓，刘聚祥

（1.河北农业大学动物医学院，保定 071000；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

多黏菌素作为饲料添加剂和治疗药物在动物养殖业中应用多年。近年来随着耐药性问题越来越严重，该药物被重新应用于人医临床，治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染，特别是碳青霉烯耐药肠杆菌感染。长期以来，多黏菌素耐药率比较低，其耐药机制主要是特定基因突变激活PmrA/PmrB和PhoP/PhoQ双调控系统，对细胞膜LPS中的脂质A修饰后导致耐药[1]。2016年，多黏菌素耐药基因mcr-1首次在中国被发现[2]，由于其主要由质粒携带，可以在不同细菌间横向传播，使多黏菌素耐药率持续快速升高，引起了全世界的关注与重视，丹麦、法国、新西兰等近50个国家相继检测到了该基因[3]。此外，人源临床分离菌中也检测到了mcr-1，但其检出率远远低于养殖动物源细菌[4-6]，Yi等[7]提出，人源临床分离菌中检测到的mcr-1很可能也来源于动物中的mcr-1基因。

探明耐药菌的亲缘关系对耐药传播机制研究和耐药性防控十分重要。常用的分子分型方法有脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、随机扩增多态性分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、多位点可变数目串联重复序列（multiple locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA）和核糖体分型等[8-9]。本研究对我国9个省份33个猪养殖场中mcr-1的流行情况进行调查，采用PFGE和RAPD两种方法分析mcr-1阳性菌株的亲缘关系，并对两种方法的分型能力和操作可行性进行比较，为猪源mcr-1耐药菌株的防控及分子分型方法的选择提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源2016～2017年，自我国青海、四川、北京、贵州、海南、江西、山西、山东、新疆共9个省市自治区33个猪养殖场，用无菌拭子采集粪便样品，共计采取122份样品。

1.2 主要试剂麦康凯固体培养基（MacConkey Agar，MAC）、脑心浸液培养基（Brain Heart Infusion，BHI）购自北京路桥有限公司；限制性内切酶XbaI及配套的酶切缓冲液购自宝生物工程（上海）有限公司；PCR Premix反应体系、粪便DNA提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；多黏菌素E、万古霉素均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.3 菌株的分离用无菌接种环蘸取粪便样品，划线于含有多黏菌素E（3 mg/L）和万古霉素（20 mg/L）的MAC培养基上，37℃过夜培养后，每个样品随机挑取一个菌落，再次划线纯化后，挑取单克隆菌落于1 mL BHI培养基中，37℃条件下200 rpm过夜培养。使用20%的甘油保种，于-80℃冻存备用。

1.4 耐药基因mcr-1的检测及菌种鉴定按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取细菌基因组DNA作为模板进行PCR扩增。上游引物F：5'-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-3'；下游引物R：5'-CTTGGTCGGTCTGTAGGG-3'[10]。扩增引物由Invitrogen公司合成。扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物纯化测序证实其为mcr-1基因。对mcr-1阳性菌株经16S rRNA测序进行种属鉴定。

1.5 mcr-1阳性大肠杆菌同源性聚类分析

1.5.1 PFGE分型 根据美国疾病预防控制中心Pulse Net[11]的PFGE分子分型的大肠杆菌标准化实验室操作，采用XbaⅠ限制性内切酶对细菌基因组进行酶切。设置电泳参数为：起始转换时间2.2 s，终止转换时间54.2 s，电泳时间19 h，电压6 V/cm，电场夹角120°。脉冲场凝胶电泳是一种分离大分子DNA或染色体的方法，在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种有一定夹角（90°或20°或180°）的方向变动，电场转换后，相对较小的分子可以较快地转变移动方向，较大的分子在转向时较为困难，这样使不同分子量大小的DNA片段在脉冲场凝胶电泳中能有效地分离开来[12]。

使用BioNumerics 7.1软件进行分析，以沙门菌H9812为标准菌株进行校准，标定条带位置，根据Dice系数确定菌株间的同源关系，以相似性系数为80%作为同一谱型划分依据[13]，根据图谱之间的相似性系数，用非加权配对算术平均法（unweighted pair groupaverage method，UPGMA）进行聚类，并生成聚类树。

1.5.2 RAPD分型 RAPD是在PCR基础上发展起来的一种简单且快速的可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的技术[14]，是以DNA为模板，随机引物单个加入，且引物与基因组有特定的结合位点，如果这些结合位点符合扩增的条件，即可扩增出相应的片段。理论上，在一定的扩增条件下，用相同的引物，复杂性越高的基因组产生的扩增条带也越多[15]。随机引物序列为：5'-GTTTCGCTCC-3'[16]，引物由Invitrogen公司合成；反应体系为：模板DNA 5～50 ng，25 pmol/µL随机引物，10×PCR Mix 12.5 μL，加入ddH2O补足25 μL；反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸2 min，45个循环；72℃再延伸10 min。PCR产物经2% DE琼脂糖凝胶电泳鉴定，电压设置为150 V，电泳时间约60～70 min。电泳结束后用凝胶成像系统观察拍照。

同样使用BioNumerics 7.1软件分析结果，采用与PFGE分析时相同的设置，生成聚类树。

2 结果

2.1 菌株分离鉴定及mcr-1基因检测结果从我国9个省市自治区33个猪养殖场采集的122份粪便样本中分离得到86株耐药菌株，结果见表1。经PCR检测共有63株mcr-1阳性菌株，部分电泳图谱如图1所示。PCR产物测序结果经BLAST序列比对，与登录号KP347127.1中mcr-1碱基序列同源性为100%，确认PCR产物为mcr-1片段。利用16S rRNA测序进行种属鉴定发现，63株mcr-1阳性菌株均为大肠杆菌。

图1 mcr-1基因检测电泳图Fig.1 Electrophoresis of PCR detection of mcr-1 gene

表1 我国9个省份猪源mcr-1阳性菌株分离结果Table 1 The isolation of mcr-1-positive bacteria of pig origin from 9 provinces in China

2.2 mcr-1阳性大肠杆菌同源性聚类分析

2.2.1 PFGE分型结果 63株mcr-1阳性大肠杆菌的XbaⅠ-PFGE聚类图谱见图2。将63株菌株PFGE图谱导入，结果显示：63株mcr-1阳性大肠杆菌经PFGE试验后，得到33～1135 kb的电泳条带，条带数目为8～20条。

图2 mcr-1阳性大肠杆菌XbaⅠ-PFGE树状图Fig.2 XbaⅠ-PFGE dendrogram of mcr-1-positive E.coli isolates

以相似性系数为80%作为同一谱型划分依据[13]，即图中谱型相似系数大于80%为表现出克隆关系的菌株，小于80%则视为无克隆关系。共获得56种PFGE谱型，多样性极高，仅有7组菌株表现出克隆关系，且其中6组菌株均来自于同一个地区，没有观察到优势克隆菌株，相同谱型的分离株来自同一省份的同一农场，大多数菌株来自同一省份却是位于不同的分支，没有显示出相近的亲缘关系。

2.2.2 RAPD分型结果 63株mcr-1阳性大肠杆菌的RAPD凝胶电泳图如图3所示。63株mcr-1阳性大肠杆菌经过RAPD试验后均得到了图谱，菌株条带数为1～8条。

图3 mcr-1阳性大肠杆菌的RAPD电泳图Fig.3 RAPD electrophoresis of mcr-1-positive E.coli

RAPD图谱同样使用BioNumerics 7.1软件进行分析，因此，同样以相似性系数为80%作为同一谱型划分依据[13]，即图中谱型相似系数大于80%为表现出克隆关系的菌株，小于80%则视为无克隆关系。结果显示：共获得55种RAPD谱型，有7组菌株表现出克隆关系，其中有4组菌株来自于同一个地区。

2.2.3 PFGE与RAPD分型比较 PFGE图谱与RAPD图谱对比发现，PFGE谱型更加多样化，条带数目比RAPD多且清晰度更高，其稳定性与可分析性更强。PFGE结果与RAPD结果大致相同，仅有部分菌株在使用两种分析方法时产生差异。如菌株M17GZZ5-1与菌株M17SDZ36-3在使用PFGE分析时亲缘关系较远，而RAPD显示较近。

3 讨论

多黏菌素被视为治疗革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”[17]；然而由质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1的发现严重威胁了该药的临床应用[1]。mcr-1被发现后，我国立即禁止多黏菌素作为饲料添加剂使用[18]，以期降低多黏菌素的耐药率，防止出现无药可用的局面。

本研究调查了2016～2017年从全国9个省份采集的122份粪便样品。共得到86株耐药菌株，其中63株为mcr-1阳性菌株。对63株mcr-1阳性菌鉴定发现均为大肠杆菌，该结果与Chen等[6]的报道相似，这表明mcr-1在猪养殖场中主要宿主是大肠杆菌，且流行率很高。其余的23株耐药菌株未检测到mcr-1，推测其可能携带其他多黏菌素耐药基因如mcr-2、mcr-3、mcr-4等[19-20]。

本研究对63株mcr-1阳性大肠杆菌进行分子分型试验，共得到了56个清晰的PFGE谱型，有7组菌株显示出克隆关系；从PFGE树状图中分析发现，我国mcr-1阳性大肠杆菌呈多样性，没有优势克隆菌株的出现。使用RAPD的方法对63株mcr-1阳性大肠杆菌进行分子分型试验，共得到了55个RAPD谱型，有7对菌株显示出克隆关系。通过对PFGE与RAPD的分型结果进行比较发现，有个别菌株使用两种分型方法得到的结果有些许差别，有些菌株（如菌株M17GZZ5-1和菌株M17SDZ36-3）在RAPD图谱中关系相近，在PFGE图谱中差距较大，这种情况此前有过报道[21-22]，这可能是由于RAPD的电泳图条带数目少，部分条带不清晰，对菌株进行同源性分析时造成了影响，不易分辨菌株间亲缘关系。

两种分型方法产生差异的可能是RAPD技术的稳定性差、可重复性低、分辨率低和分析力低等[23-24]导致，而PFGE稳定性好、重复性高、可分析性强，被誉为细菌分子分型的“金标准”[25]，在分析菌株克隆关系时远远优于RAPD[26-27]，目前已广泛用于流行病学调查中，是流行病学调查中分析菌株间克隆关系的有效手段。闫大琦等[28]研究发现，对影响RAPD结果的因素进行优化可以提高其稳定性与分辨率，因此在条件不允许的情况下，也可考虑采用RAPD技术。

综上所述，本研究调查了我国9个省份猪养殖场的mcr-1流行情况，发现mcr-1的主要宿主是大肠杆菌，并且流行率非常高。通过RAPD与PFGE试验，发现63株mcr-1阳性大肠杆菌中没有优势克隆菌株。对比两种分型方法获得的结果，PFGE图谱带型清晰、稳定、可分析性强；RAPD电泳图清晰但条带数目少，稳定性与可分析性相对PFGE图谱较弱。在对细菌进行分子分型时推荐使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术。对于缺乏高端设备的实验室，优化影响RAPD因素后可考虑采用RAPD技术。