兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗临床免疫效力试验

范志宇,王 芳,胡 波,魏后军,薛家宾,姜 平

(1.南京农业大学动物医学院,江苏 南京210095;2.江苏省农业科学院兽医研究所 农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室 国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏 南京 210014)

兔出血症,俗称兔瘟,于1984 年首次在江苏无锡等地发现,之后迅速蔓延至全国各地。当前,世界许多国家和地区均有该病的流行和暴发,给全球养兔业造成了巨大的经济损失[1-3]。目前,对兔瘟的预防,国内、外主要用组织灭活疫苗,由于制作组织灭活疫苗的不免疫兔瘟相关疫苗的家兔数量有限,因此疫苗抗原的来源比较缺乏,造成国内兔瘟疫苗供不应求的局面[4]。

本研究对南京天邦生物科技有限公司中试生产的3 批次兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60 株)在6 家临床试验兔场开展疫苗免疫期试验等相关研究工作,完成了该疫苗临床免疫效力评估,为该疫苗的新兽药注册申报奠定了基础。

1 材料

1.1 疫苗 3 批次经安全检验、效力检验等项目检验合格的兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60 株)中试产品(批号分别为：2013002、2013003、2013004),南京天邦生物科技有限公司中试生产;兔病毒性出血症灭活疫苗(批号：129083),南京天邦生物科技有限公司生产,2 ℃～8 ℃保存备用。

1.2 攻毒毒种 兔出血症病毒皖阜株肝毒(病毒含量≥105.5LD50/mL,或HA 效价不低于1∶256),由江苏省农业科学院兽医研究所分离、鉴定、冻干保存。

1.3 临床试验动物 不同品种：獭兔、肉兔、毛兔,不同日龄：35～42 日龄幼兔、2 月龄健康家兔,分别来自江苏A 兔场、江苏B 兔场、江苏C 兔场、山东A 兔场、浙江A 兔场、浙江B 兔场共6 家养殖场。

2 试验方法

2.1 玻片法血凝试验[5]取少量待检兔肝脏样品,置于清洁的载玻片,用剪刀将肝脏样品剪碎,滴加2 滴～3 滴1%人“O”型红细胞于肝脏样品上,同时设立兔出血症阴、阳性肝脏对照,轻轻混匀后,于玻片上孵育2 min,若有兔病毒性出血症病毒,肉眼可直接观察到玻片出现凝集现象。

2.2 临床试验实验动物选择 6 家临床试验兔场兔群必须精神状态健康,食欲、饮欲正常,实验兔未发生兔病毒性出血症,无兔病毒性出血症临床症状,无其他传染病,未接种过针对兔病毒性出血症的单苗或联苗。所有受试兔包括对照兔(哨兵兔)在开始试验后不再接种针对兔病毒性出血症的其他单苗或联苗,直至试验结束。

在江苏A 兔场、山东A 兔场、江苏B 兔场进行肉兔试验,分别在3 家试验兔场选择35～42 日龄幼兔、2 月龄健康家兔,备用;在浙江A 兔场、浙江B 兔场进行獭兔试验,分别在2 家试验兔场选择35～42日龄幼兔、2 月龄健康家兔,备用;在江苏C 兔场进行毛兔试验,选择35～42 日龄幼兔、2 月龄健康家兔,备用。

2.3 动物分组和免疫 使用批号2013002 疫苗分别在江苏A 兔场、浙江A 兔场、江苏C 兔场和浙江B 兔场进行免疫,使用批号2013003 疫苗在山东A兔场进行免疫,使用批号2013004 疫苗在江苏B 兔场进行免疫;使用批号129083 分别在6 家兔场免疫35～42 日龄幼兔和2 月龄健康兔;同时有一定数量的不同日龄家兔留作对照兔,皮下注射灭菌生理盐水,不接种疫苗。

2.4 临床效力试验 临床效力试验过程中对死亡兔进行剖检,如有疑似兔出血症症状死亡兔要带回实验室进行检测,参照中华人民共和国农业行业标准进行病毒检测,确定是否死于兔出血症。

2.5 抽检攻毒试验 分别在注射后第150、210 天分别在6 家试验兔场随机选择中试产品和同类疫苗免疫幼兔和仔兔包括对照兔,5 只/组/批/次,带回实验室,采用攻毒法进行效力检验,各皮下注射兔出血症病毒皖阜株肝毒1 mL,连续观察7 日,记录死亡与保护的动物数量,对死亡兔进行剖检观察并取肝脏进行人“O”型红细胞凝集试验。

2.6 血清抗体测定 对6 家临床试验兔场1 mL/只免疫的2 月龄兔,每家兔场随机选择10 只,免疫后每隔30 日进行1 次血液采集,带回实验室分离血清,-20 ℃冻存备检,连续采集7 个月。使用实验室建立的血凝抑制(HI)方法和ELISA 方法进行抗体检测,并进行统计分析。

3 结果

3.1 临床效力试验 兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60 株)中试产品相继在江苏A 兔场、江苏B 兔场、江苏C 兔场、山东A 兔场、浙江A兔场、浙江B 兔场共6 家养殖场进行中试免疫试验,共使用中试产品疫苗免疫家兔29 565 只,其中幼兔24 313 只、2 月龄兔1 820 只、仔兔1 607 只、孕兔1 225 只;使用兔病毒性出血症灭活疫苗免疫家兔2 400 只,其中幼兔1 200 只,2 月龄兔1 200 只;设立未免疫对照兔(岗哨兔)360 只,其中肉兔120只、獭兔180 只,毛兔60 只;以上所有家兔在试验期间均没有发生兔出血症,6 家兔场中试疫苗免疫组、同类疫苗免疫组和对照组出栏率差异不明显。说明兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗中试产品可以保护免疫兔场不发生兔出血症。

3.2 抽检攻毒试验 中试产品和同类产品分别免疫后第150、210 天攻毒,攻毒后进行观察,如果攻毒兔出现以下症状为疑似兔出血症,需用玻片法进行凝集试验确诊。攻毒兔死前表现短暂的兴奋,突然倒地,划动四肢呈游泳状,濒死时抽搐,角弓反张,眼球突出,惨叫几声而死,典型病例可见鼻孔流出血样液体,肛门松弛,肛周有少量淡黄色黏液附着。剖检可见肺有不同程度充血、瘀血;肝脏淤血、肿大、质脆,表面呈淡黄色或灰白色条纹,切面粗糙;脾脏淤血、肿大,呈蓝紫色;肾脏和胸腺水肿、肿大,并有散在性针尖至粟粒大出血点(见中插彩版图1)。

图1 典型兔出血症症状和剖检病变

如出现兔出血症典型的病理变化,对死亡兔肝脏悬液作人“O”型红细胞凝集试验进行确诊。结果显示,玻片凝集试验结果均为阳性,死亡兔均为兔出血症特异性死亡(见中插彩版图2)。

图2 玻片凝集试验

使用同一批次(批号2013002)中试产品或同类疫苗免疫肉兔、獭兔、毛兔的免疫期攻毒效力检验,结果显示,同批次疫苗对不同品种家兔均可以产生7 个月的保护;使用不同批次(批号2013002、2013003、2013004)中试产品或同类疫苗免疫肉兔进行免疫期攻毒,免疫兔均健活,对照兔至少死亡4只,说明不同批次疫苗对同一品种也可以产生7 个月的保护。结果说明,兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗的免疫期为7 个月。见表2。

表1 临床效力试验统计结果

表2 抽检攻毒试验结果

3.3 血清抗体测定 对6 家临床试验兔场1 mL/只免疫的2 月龄兔,将免疫后7 个月内每月采集的血清用血凝抑制(HI)方法和ELISA 方法进行抗体检测,并进行统计分析(见中插彩版图3 和图4)。结果显示,免疫后1 个月,家兔血清抗体HI 效价达到1∶23.13,免疫后3 个月,家兔血清抗体HI 效价达到高峰,此后逐渐下降,注射疫苗后7 个月其血清中平均抗体水平仍维持在1∶23以上,对照组家兔血清抗体平均HI 效价在1∶2～1∶20.4之间。不同批次疫苗免疫兔和同批次疫苗免疫肉兔血清抗体HI 效价没有显著差异。薛家宾等研究结果也显示[6],家兔血清抗体HI 效价达到1∶23及以上时,可以100%抵抗RHDV 强毒攻击。本试验抗体测定结果说明,兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗可以产生7 个月的保护。

图3 不同批次疫苗肉兔免疫持续期血清HI 效价

图4 同批次疫苗不同品种家兔免疫持续期血清HI 效价

对临床试验兔场1 mL/只免疫的2 月龄兔,将免疫后7 个月内每月采集的血清用ELISA 方法进行抗体检测,并进行统计分析(中插彩版图5 和图6)。结果显示,免疫后1 个月,家兔免疫组血清ELISA 方法OD450nm平均值达到0.800 2,与当月对照组血清ELISA 方法OD450nm平均值0.168 5 有显著差异;免疫后4 个月,家兔血清ELISA 方法OD450nm平均值达到高峰,免疫组ELISA 方法OD450nm平均值为1.081 2,对照组血清ELISA 方法OD450nm平均值为0.125 1;此后3 个月变化不明显,注射疫苗后7 个月其血清ELISA 方法OD450nm平均值仍维持在1.038 8,对照组家兔所有血清ELISA方法OD450nm平均值为0.160 9,与免疫组有显著差异。不同批次疫苗免疫兔和同批次疫苗免疫肉兔家兔血清ELISA 方法OD450nm平均值没有明显差异。

图5 不同批次疫苗肉兔免疫持续期血清ELISA 值

图6 同批次疫苗不同品种家兔免疫持续期血清ELISA 值

4 讨论

由于市售兔病毒性出血症灭活疫苗存在种种缺点,研究人员对兔出血症疫苗的研究逐步转向既有保护作用,同时没有生物安全隐患的基因工程疫苗。近年来,国内外开展了大量的相关研究,试验证明RHDV 的主要结构蛋白VP60 能在多种载体系统中表达,并可以形成与天然RHDV 病毒粒子免疫原性无任何差异的病毒样颗粒[7-9]。王芳等通过分子生物学技术使兔出血症病毒衣壳蛋白基因在杆状病毒系统表达,试验证明所表达的衣壳蛋白具有良好的免疫原性[10]。宋艳华等应用VP60-ELISA 方法测定RHDV 特异性抗体,结果显示RHDV-VP60 疫苗免疫后VP60 特异性抗体可以在高水平维持240 d[11]。

本研究制备的兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60 株)在6 家临床试验兔场免疫健康家兔,免疫期间没有发生兔出血症;免疫持续期抽检用致死剂量的兔出血症病毒攻击保护率都可以达100%,结果显示,疫苗对肉兔、獭兔、毛兔免疫期均可以达到7 个月。以上结果表明,兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60 株)临床效力检验合格,免疫期为7 个月,也进一步证明了国内外学者的研究报道[12]。兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(BAC-VP60 株)于2017 年2 月获得国家一类新兽药注册证书([2017]新兽药证字06 号),该疫苗将替代兔病毒性出血症灭活疫苗,在兔瘟的免疫防控中起到重要作用,从而促进我国家兔疾病防控事业的健康、持续、稳定发展。