水产品生物胺检测技术研究进展

刘亚楠，李 欢，陈 剑，苏来金，傅玲琳，王彦波,*

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018；2.温州大学生命与环境科学学院，温州市特色食品资源工程技术研究中心，浙江 温州 325000）

水产品富含优质蛋白和其他重要营养物质，是人类食物的重要来源之一。研究表明，截至2050年，来自海洋的食品年总产量将比当前增加36%～74%，可提供 相当于98亿 人口所需肉类总增量的12%～25%[1]。水产品含有丰富的蛋白质等营养物质，但极易滋生大量微生物而发生腐败变质，产生生物胺。生物胺是一类具有生物活性、低分子质量碱性含氮化合物的总称，生物胺的产生途径有两种：由含氨基酸脱羧酶的微生物作用于游离氨基酸脱羧产生；由醛酮类化合物的氨基化和转氨基作用生成[2-3]。水产品中常见的生物胺有8 种，根据分子结构特征可分为3大类：脂肪族胺（腐胺、尸胺、精胺和亚精胺）、芳香族胺（酪胺和苯乙胺）和杂环胺（组胺和色胺）[3-4]；根据氨基数目分为单胺（组胺、酪胺、色胺和苯乙胺）和多胺（尸胺、腐胺、精胺和亚精胺）[4]。

适量的生物胺是人体中必不可少的组成部分，具有调节核酸与蛋白质合成及生物膜稳定性的作用[4]。但是过量生物胺则会对人体造成一定的伤害，如摄入3 mg的苯乙胺会引起偏头痛、8～40 mg的组胺即可引起轻微中毒[4]。 水产品等蛋白质含量丰富的食品在加工和保藏过程中极易产生生物胺。生物胺无法通过低温冷冻或者高温加热等方式消除[5]，且一旦误食含有大量生物胺的食品，可能会引起呕吐、腹泻等食物中毒现象。鉴于此，水产品中生物胺超标问题引起了政府和公众的广泛关注，及时发现水产品中过量的生物胺，保障水产品品质和食用安全，就显得尤为重要。建立准确、快速的生物胺检测方法，高效精准地检测水产品中生物胺的种类和含量，是保障水产品食用品质和安全的重要基础，也逐渐成为保障水产品食用品质和安全的研究热点。

1 水产品中的生物胺

1.1 生物胺形成机制

生物胺广泛存在于食品尤其是富含蛋白质的水产品中。水产品中生物胺的产生主要是水产品中蛋白质在蛋白酶和肽酶的作用下分解为氨基酸，继而在微生物氨基酸脱羧酶的作用下进行脱羧反应产生生物胺。水产品中的微生物并非都含氨基酸脱羧酶，且所携带的氨基酸脱羧酶不同，生成的生物胺种类也不同。研究表明[6-8]，葡萄球菌（Staphylococcus），弧菌（Vibrio），肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和假单胞菌（Pseudomonas）是水产品中主要的组胺产生菌；芽孢杆菌（Paenibacillus）和肉食杆菌（Carnobacterium divergens）是主要的酪胺产生菌株；大肠杆菌（Escherichia coli）和阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae）是主要的腐胺产生菌株；产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）、植生拉乌尔菌（Raoultella planticola）和抗坏血酸克吕沃尔菌（Kluyvera ascorbata）是主要的尸胺产生菌种。除需要有前体物质氨基酸和含氨基酸脱羧酶的微生物外，生物胺的合成还需要具有满足适宜含氨基酸脱羧酶的微生物生长以及氨基酸脱羧酶合成与作用的环境条件[9]，其生物合成途径如图1所示。

图1 生物胺的生物合成途径[4,10]Fig.1 Biosynthesis pathways of biogenic amines[4,10]

1.2 生物胺对人体的危害

生物胺是人体内必不可少的组成成分，适量的生物胺具有清除自由基，抗氧化[11]，调节细胞生长、基因表达[12]、心率和细胞免疫[13]等生理功能。在正常生理条件下，生物胺可以被机体内的胺氧化酶分解代谢。但摄入过量生物胺，超过人体胺氧化酶的代谢能力时，未被代谢的生物胺则会在体内堆积对人体健康产生危害[14-15]。如表1所示，不同生物胺作用于不同器官，产生的毒性有所不同。

表1 不同生物胺的毒性作用Table 1 Toxicity of different biogenic amines

1.3 生物胺在水产品中的限量标准

相关研究表明，生物胺在水产品中广泛存在（表2）[18-25]且部分水产品生物胺含量超标。过量的生物胺会引起腹泻、头痛等不良反应，同时还可与水产品中的防腐剂亚硝酸盐反应生成亚硝胺等致癌物质[7]，危害人体健康。鉴于此，不同国家对水产品中的生物胺进行限量以保障其食用安全（表3）。

表2 不同水产品生物胺种类和含量Table 2 Types and contents of biogenic amines in different aquatic products

表3 不同国家对水产品中生物胺的限量标准Table 3 Maximum residue limits for biogenic amines in different countries

续表2

2 生物胺间接检测技术

间接检测技术主要通过测定水产品中的产胺菌的存在和数量来实现，包括微生物学法和分子生物学法，产胺菌的存在为证明水产品中生物胺存在提供了一定的参考信息，因此可以作为简便、快速检测生物胺存在的方法。但检测出产胺菌的存在并不代表产生的生物胺含量一定高，这两种方法只能作为间接测定生物胺的方法。因此，将微生物学法或分子生物学法与数学模型相结合可作为一种更准确检测是否含有生物胺及生物胺含量的技术手段。

2.1 微生物学法

微生物学法主要是根据产胺菌的生理特性借助于不同的选择性培养基来鉴定产胺菌。Niven培养基是最早设计也是最常用的选择性培养基，通过培养基中的酸碱指示剂溴甲酚紫对产胺菌代谢产物碱性生物胺进行显色从而筛选出产胺菌[29]。但微生物代谢系统复杂，培养基会对其他碱性代谢产物显色造成假阳性的结果[30]，Mavromatis等[31]对Niven培养基进行了参数调整以降低假阳性率。周卫枫等[32]设计二步法，采用3 种选择性培养基分别筛选鱼肉中的组胺产生菌后再用比色法进行组胺的定性和定量，该方法进一步提高了准确率。Roig-Sagués等[33]同样根据二步法用7 种选择性培养基筛选目标产胺菌，已被应用于金枪鱼和凤尾鱼的产胺菌检测中[34-35]。

2.2 分子生物学法

分子生物学法检测产胺菌主要是基于微生物中 氨基酸脱羧酶基因保守性的原理，其中聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是最为广泛用于检测产胺菌的方法。目前，已使用多种脱羧酶基因引物检测产胺菌脱羧酶从而实现产胺菌的检测（表4）。 Björnsdóttir-Butler等[36]将4 种高产组胺菌株（Morganella morganii、E.aerogenes、R.planticola和Photobacterium damselae）的组氨酸脱羧酶（histidine decarboxylase，HDC）基因进行PCR扩增，产生两个片段（709 bp和249 bp）， 将片段用地高辛标记后分别检测组胺产生菌，发现709 bp 探针的等比例混合物对高组胺产生菌株具有高特异性。Wongsariya等[37]根据11 株组胺产生菌的Hdc基因保守区构建引物（Hdc-2F/2R）用来检测M.morganii和E.aerogenes的存在和含量。结果发现，Hdc-2F/2R引物能够在组胺水平低于50 mg/kg时检测出产胺菌M.morganii和E.aerogenes的存在，该方法可以在组胺水平达到污染控制水平之前检测到产胺菌的存在。然而，单一PCR只能检测一种产胺菌，当需要对食品中所有重要生物胺的产胺菌检测时则存在耗时长的缺点，因此多重PCR技术被应用于快速检测多种产胺菌。de las Rivas等[38]为了快速检测食品中可产生组胺、酪胺、腐胺和尸胺的产胺菌，建立了可同时检测这些产胺菌的多重PCR方法。通过与数据库中组胺、酪胺、腐胺和尸胺产胺菌蛋白质组序列比对后选择保守结构域设计引物，引物允许相应脱羧酶基因的扩增但不允许其他基因扩增从而筛选出产4 种生物胺的食源性细菌。多重PCR技术为快速检测水产品中产胺菌提供了一种可靠的诊断工具，也为生物胺风险预警提供参考依据。

表4 检测产胺菌的氨基酸脱羧酶PCR引物Table 4 Polymerase chain reaction primers for detecting amino acid decarboxylases

3 直接检测技术

3.1 基于色谱法检测生物胺

基于色谱法检测生物胺是因为不同生物胺理化性质不同，可利用与固定相之间的亲和力差异实现生物胺 与其他物质的分离，再结合各类检测器进行分析。其中常见的检测方法有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、气相色谱（gas chromatographic，GC）法、薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）法等（表5）。其中HPLC是最常用的方法，HPLC利用样品中生物胺与其他组分在固定相和流动相连续交换的过程中，由于在两相之间存在洗脱能力、溶解力等性质差异彼此分离，从而实现对生物胺的检测。Altieri等[41]采用反相高效液相色谱（reversedphase HPLC，RP-HPLC）法对鱼和鱼产品中组胺含量进行检测，其检出限和定量限分别为3 mg/kg和10 mg/kg，但该方法存在检测分析时间较长的不足。Mayer等[42]为解决HPLC分析生物胺耗时长的不足，根据塔板速率理论使用亚2 μm粒径的色谱柱对样品中的生物胺实现快速、高效的分离，从而快速检测生物胺含量。该方法对样品中生物胺的检出限为1～3.3 mg/kg，分析时间为9 min，该方法在不降低灵敏度的前提下大大缩短了检测时间。GC原理和HPLC基本相同，但是主要用于分析挥发性生物胺，非挥发性生物胺则需衍生为易挥发的物质才能进行检测。Li Chenghui等[43]将介质阻挡放电分子发射光谱仪串联气相色谱检测鲤鱼中二甲胺和三甲胺等挥发性胺，其中将纳米SiO2作为催化剂以增强胺的发射信号，检出限为4.4 μg和2.5 μg。Hwang等[44]采用碱性甲醇提取鱼和鱼制品中的组胺后直接进行检测，无需衍生化。该方法检出限为5 mg/kg，可快速简便地检测出水产品中的非挥发性生物胺。HPLC和GC法具有较高的灵敏度和准确度，但存在仪器昴贵、操作费时等缺点，不适合大批量样品检测。

表5 基于色谱法检测水产品中的生物胺Table 5 Recent studies on detection of biogenic amines in aquatic products by chromatography methods

TLC法是利用生物胺与其他物质对吸附剂的吸附能力和分配系数不同使混合物在固定相上得以分离，根据样品比移值与对照物的比移值确定生物胺含量。 Lapa-Guimarães等[45]建立了一种用丹磺酰氯衍生生物胺后用荧光密度法进行含量检测的TLC法，该方法对色胺、酪胺、组胺和β-苯乙胺的检出限为10 ng/g，对胍胺、腐胺、尸胺、精胺、亚精胺的检出限为5 ng/g。Tao Zhihua等[46]采用TLC法检测鱼和鱼制品中的组胺，利用数字化计算和图像处理软件对斑点强度进行数据分析。该方法可快速分析出组胺含量，其检出限为20 mg/kg。TLC法无需昴贵的检测设备，操作简便，但准确度不高、重复性差。

综上所述，基于色谱法检测生物胺是目前应用最为广泛的分析方法，具有检测灵敏度高、准确度高等优点，但大部分方法在分析过程中需对生物胺进行衍生化处理且需要大型分析仪器，因此操作方法更简便和研发小型分析仪器仍然是色谱法检测的难点和发展方向。

3.2 基于免疫识别检测水产品中生物胺

免疫识别原理是将生物胺作为抗原，利用生物识别元素与抗原结合后进行含量检测。常用的免生物识别元素有抗体、核酸适配体、肽、分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）等（表6）。

表6 基于免疫识别检测水产品中的生物胺Table 6 Recent studies on detection of biogenic amines in aquatic products based on immune recognition

Sheng Wei等[53]利用竞争性多克隆抗体ciELISA法测定了肉类和海产品中的酪胺含量。将酪胺与牛血清白蛋白（bull serum albumin，BSA）偶联作为抗原注射到兔子体内以刺激体内产生针对酪胺的抗体，用于ciELISA法检测酪胺的含量。该方法对酪胺的检出限为1.2 mg/kg，回收率为85.6%～102.6%。在上述方法中由于生物胺分子质量小，直接与蛋白偶联制备的抗原刺激动物体内所产生的抗体特异性较差，因此袁利鹏等[54]将组胺衍生化，制备出可特异性识别组胺衍生物的抗体以此提高特异性和灵敏度，采用Sheng Wei等[53]利用ciELISA法测定鱼、虾和贝类中组胺含量，该方法的检出限为0.1 ng/mL，回收率为98.9%～130.1%。

除采用抗体作为生物识别元素检测生物胺外，Lerga等[58]设计了一种核酸适配体结合金纳米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）检测鱼肉中的组胺。核酸适配体通过非静电作用被吸附在AuNPs上，使AuNPs免受盐诱导聚集，从而保持分散、呈现红色；当目标物组胺存在时，适配体与组胺结合，核酸适配体从AuNPs上脱离，加盐诱导AuNPs聚集变成蓝色。该方法可通过纳米颗粒的颜色变化直观检测出组胺且灵敏度高，检测限为8 nmol/L。Shi Rongjia等[59]通过生物筛选方法从噬菌体展示文库中选择对组胺具有高亲和力的肽，将肽与碳量子点结合检测鱼肉中的组胺。碳量子点的荧光电子转移可以被肽猝灭，当组胺存在时可与肽结合使碳量子点荧光恢复（图2），通过这个原理测定荧光强度进行组胺定量，对组胺的检出限为13.0 μg/L。

图2 NAC-碳量子点/Hisp3-2-C检测组胺示意图[59]Fig.2 Schematic diagram of N-acetyl-cysteine-carbon quantum dots/histamine peptide 3-cysteine for the detection of histamine[59]

近年来，MIP已逐渐替代抗体、核酸适配体等作为一种新型生物识别元素检测水产品中的生物胺。Mattsson等[61]开发了一种基于竞争性的荧光MIP假免疫测定法检测金枪鱼罐头中组胺的含量。该方法利用荧光标记的组胺衍生物作为配体和组胺在溶液中共同竞争MIP结合位点的原理，通过测量荧光强度确定组胺含量，检出限为1 μmol/L。Gao Fang等[62]利用MIP-聚氯乙烯-SERS法测定金枪鱼中组胺的含量（图3）。通过AuNPs表面的负电荷与组胺正电荷的静电吸引作用，使组胺吸附在AuNPs表面，AuNPs作为表面增强光谱的基底增强组胺光谱信号以此实现组胺的检测，对组胺的检出限为3 mg/kg。

图3 MIP-聚氯乙烯-SERS法检测组胺示意图[62]Fig.3 Schematic diagram of molecularly imprinted polymer-polyvinyl chloride-surface-enhanced Raman spectroscopy for the detection of histamine[62]

综上，基于免疫识别原理制备出的生物识别元素可特异性检测水产品中某一种生物胺，但生物胺分子质量较小，制备出的生物识别元素灵敏度并不高且制备过程耗时耗力，制备具有高灵敏度的可特异性识别生物胺的生物识别元素仍是目前的研究趋势。因此将生物胺衍生化后制备生物识别元素或者结合纳米材料等其他物质增强信号可以提高灵敏度，为精准检测生物胺提供一定的技术支持。

3.3 基于酶促反应检测水产品中生物胺

相比较于HPLC、GC、TLC等方法，生物传感器因其设计简单、低成本和小型化成为检测生物胺的热点方法，其中基于酶促反应的生物传感器在检测水产品生物胺中应用十分广泛。基于酶促反应检测生物胺主要是因为在分子氧的存在下，胺可以被胺氧化酶催化产生过氧化氢、氨气和醛类物质，通过测定这些生成物的产生量或者反应物的消耗量可以来描述生物胺的水平。

Omanovic-Miklicanin等[64]基于胺与腐胺氧化酶（putrescine oxidase，PUO）或二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）的酶促反应产物过氧化氢可以与鲁米诺试剂反应发光的原理制成两种光学生物传感器检测鱼肉等肉品中的腐胺。两种传感器对腐胺的检出限分别为 0.8 mg/L和1.3 mg/L，该类传感器可简便、快速地通过颜色变化检测生物胺，但检出限较高。Pospiskova等[65]将酶固定在磁性微粒中，与钌化合物一起封装到聚合物后沉积到透射电子显微镜中，将透射电子显微镜通过光纤维连接到光电探测器中，利用酶促反应耗氧催化胺的原理测量钌化合物的荧光寿命变化进行生物胺含量检测。该方法中的酶具有长期活性，对生物胺的检出限可达微摩尔级，对腐胺和尸胺灵敏度最高，检出限为25～30 μmol/L。

Pérez等[66]将DAO和HRP通过相反转技术固定在聚砜/多壁碳纳米管（multlwalled carbon nanotubes，MWCNT）/二茂铁（ferrocene，Fc）膜中，膜沉积到丝网印刷电极上制备电化学生物传感器。生物胺在DAO存在下被催化为过氧化氢、氨气和醛类物质，其中过氧化氢电化学氧化产生电子，进而产生电流，在电极表面检测到电信号的变化量代表生物胺含量。张敏等[67]将变性血红蛋白（unfolded hemoglobin，uHb）固定在黏土-纳米 金复合材料修饰的电极表面，戊二醛作为交联剂固定DAO。通过测定电流值确定尸胺浓度。该方法的uHb与其他过氧化酶相比对H2O2的催化能力更强，提高了灵敏度，对尸胺的检出限为6.7×10-13mol/L。这些方法虽然操作简便、灵敏度较高，但存在固定化膜不稳定的缺点。Hooda等[68]将多胺氧化酶和DAO固定在壳聚糖/椰子纤维/氧化锌纳米条上进行水果和蔬菜中精胺、亚精胺和腐胺的检测。高拉伸强度的椰子纤维增强了膜的稳定性，加入氧化锌纳米颗粒的固定化膜中的酶活性保留率和酶载量也大大增加。该方法提高了膜的稳定性和酶活性，为应用到检测水产品生物胺提供了一定的思路。

结合相关研究结果，目前，生物传感器因其高性能、低成本和小型化等优点在现有的生物胺检测方法中处于领先地位，基于酶促反应的酶生物传感器将酶的选择性与目标分析物的鉴定结合起来，将生物催化反应的产物量直接转化为光、电信号从而实现生物胺快速和准确的检测。然而，酶生物传感器中存在酶的固定化不稳定和催化效率低等问题，影响传感器的稳定性和灵敏度。因此研制新型固定化膜和更高效的催化物质并将其用于制备生物传感器，实现固定化酶的更稳定和更高的反应效率是目前的研究趋势。基于酶促反应的生物传感器在检测水产品生物胺中应用的总结见表7。

表7 基于酶促反应检测水产品中的生物胺Table 7 Recent literature on enzymatic detection of biogenic amines in aquatic products

3.4 基于酸碱度变化检测水产品中的生物胺

pH指示剂是指示酸碱变化最直接、最常用的物质，如花青素、甲基红、姜黄素、溴甲酚绿、溴酚蓝等。生物胺是一类低分子质量碱性含氮化合物的总称，因此可以利用生物胺的碱性性质进行水产品生物胺的定性和定量（表8）。翟晓东[72]将对pH值敏感的姜黄素掺入低密度聚乙烯中，通过熔融挤出吹膜法制备成比色膜检测鲢鱼中的挥发性生物胺。当遇到碱性生物胺后，薄膜呈现从黄色至棕色的变化。这些pH指示剂虽然可以检测出生物胺的存在，但只能提供半定量信息和较低的灵敏度。Siripongpreda等[73]将pH敏感型染料溴甲酚紫采用吸附法固定在多孔聚乳酸基质上制成比色传感器，与以氧化石墨烯作为基底的激光解吸电离质谱联用建立双重检测平台实现生物胺的定性和定量。遇到碱性生物胺后可直观快速观察到比色传感器从黄色变成紫色；在另一层上，以氧化石墨烯作为基底的激光解吸电离质谱通过相对分子质量对生物胺进行定量，对腐胺和尸胺的检出限分别为0.07 pmol/L和0.02 pmol/L。比色传感器的简便快速与激光解吸电离质谱的高灵敏度为直观、准确检测食品中的生物胺提供了保障，但该方法需要昴贵和复杂的设备。Guo Lingling等[74]设计了一种由20 种不同比例的壳聚糖纳米颗粒-染料/醋酸纤维素组成的比色条形码检测鱼肉、鸡肉和牛肉中的生物胺含量等新鲜度指标。当条形码暴露于不同浓度的不同生物胺气体时，条形码中染料的生色团会根据酸碱度变化而改变颜色。以溴百里酚蓝为例，遇到碱性生物胺后，条形码从黄色变成蓝色。为了更加实时、准确地预测肉品的新鲜度，他们采用深度卷积神经网络（deep convolutional neural networks，DCNN）系统对比色条形码进行学习、识别和处理，从而形成了肉品新鲜度的DCNN评价数据集并将DCNN数据集上传到云端中，该方法通过使用智能手机应用程序界面可实时快速地监控肉品新鲜度，总体预测准确率为98.5%（图4）。

表8 基于酸碱度变化检测水产品中生物胺Table 8 Recent literature on detection of biogenic amines in aquatic products based on pH response

图4 人类对气味分子的感知和比色条码结合DCNN系统的模仿嗅觉系统对生物胺等新鲜度指标检测原理图[74]Fig.4 Principle diagram of human perception of odor molecules and colorimetric bar code combined with deep convolutional neural network to simulate olfactory system for the detection of bioamines and other freshness indicators[74]

采用酸碱性敏感的指示剂可以检测生物胺，但存在颜色分辨率低的问题。因此利用酸碱性变化引起能量转移或结构变化导致颜色变化等原理检测生物胺也是近年来研究的热点。Χu Χiaoyu等[75]将甲基红与镧系金属有机框架共价结合制备成生物胺传感器。该传感器有两个发射中心，利用pH值诱导能量转移原理，甲基红荧光增加，Eu3+荧光强度降低，从而表现出明显颜色变化。该传感器的高量子产率和有序孔结构提高了传感器的灵敏度，对组胺的检出限为0.1 μmol/L。Lin Tianran等[76]将AuNPs、间苯二酚单乙酸盐（resorcinol monoacetate，RMA）和硝酸银（AgNO3）固定在琼脂糖凝胶中制备了一种传感器。碱性生物胺引起RMA水解生成还原产物，还原AgNO3产生金属银附在AuNPs表面导致纳米粒子 长宽比和表面组成发生变化，从而使局域表面等离子体共振吸收峰发生蓝移，AuNPs出现明显颜色变化，对三甲胺的检出限为8.6×10-9mol/dm3。

前期研究结果表明，基于酸碱度变化导致颜色变化检测生物胺是最直接和直观的检测方法，但基于这类原理检测生物胺只能提供定性和半定量信息，灵敏度和特异性较低。因此，根据酸碱度变化引起其他变化（能量转移或结构变化等）从而提供生物胺的定性和定量信息是目前的研究趋势。同时，将基于酸碱度变化导致颜色变化与DCNN等数学模型联用可为提高灵敏度和准确度提供一定的技术支撑。

4 结 语

水产品因自身的营养特性，容易滋生微生物而导致腐败变质，这一过程会产生大量生物胺。过量摄入生物胺会对人体健康构成潜在的安全风险，因此准确快速地检测水产品中生物胺含量对于水产品行业的可持续发展以及保障水产品食用安全至关重要。虽然随着研究的深入，各种检测技术的准确性和灵敏度都有了很大的提高，但如何快速准确和特异性检测水产品中的生物胺仍是本领域面临的难题。本综述对检测方法原理进行分类讨论并对其优缺点和发展方向进行总结，旨在通过对原理创新并结合新的技术手段应用于今后水产品生物胺的检测中，为水产品中生物胺的高效检测提供参考，对保障水产品品质和安全、助力大健康背景下健康中国和食品安全国家战略具有重要的现实意义。