羧甲基普鲁兰多糖螯合钙的制备及其功效评价

李海鹰，杨祥禾，魏珍珍，贾 蓓，杨文智*

（河北大学药学院，河北省药物质量分析控制重点实验室，河北 保定 071002）

钙是人体所含最丰富的营养素，且参与了一系列生理过程，如骨骼发育、血管收缩、血管扩张、肌肉功能、神经传递、细胞内信号和激素分泌[1]。人生长、发育及衰老过程中，钙摄入后得到良好的吸收是增强或稳定骨量的关键。有报道显示，青少年摄取钙量与骨密度关系密切[2]， 发育期缺钙，则成熟骨骼的骨峰值低，会增加骨质疏松的患病风险。一般男性和女性分别在21 周岁和19 周岁时骨量达到峰值，此后骨量增长停滞[3]，中年后骨量明显损失，每年损失总骨量的0.5%～1%[4]。研究表明增加钙摄入量可使骨折风险降低12%[5]。为了保证较高的骨密度，老年人日摄入800 mg钙可有效预防骨流失[6-7]。根据年龄和性别不同，成人每日钙摄入量应在500～1 200 mg之间[8]。 虽然钙可从膳食中摄取，但日常饮食难以达到推荐摄入量[9]，调查发现大多数东南亚国家人群的平均膳食钙摄入量低于400 mg/d[10]。2017年《中国家庭健康大数据报告》发布，“补钙”一词榜上有名，中国人钙元素缺失排名第一[11]。因此，补钙制剂也是人群关注的热点。

市场上的补钙制剂可分为无机钙、有机酸钙、有机钙和天然生物活性钙，这些补钙制剂各有优缺点，生物利用度也不尽相同[12-14]。无机钙（如碳酸钙），钙含量高且价格低，但体内吸收率低，易引发结石，从而影响服用者正常的胃肠道功能，此外胃酸分泌差的人群存在严重的吸收问题。有机酸钙可改善无机钙的上述缺点，但葡萄糖酸钙中钙含量相对较低，且高糖成分不适合糖尿病患者；乳酸钙进入消化道产生乳酸根离子，能引起机体酸痛或疲劳；醋酸钙会抑制小肠对锌等微量元素吸收，提升高钙血症的风险[12]。有机钙主要是氨基酸或复合氨基酸螯合钙，钙离子与酸根结合稳定，此类补钙制剂具有左旋结构和较好的脂溶性，显示出良好的生物活性，但其制备工艺相对复杂且价格贵[15]。近年来，研究者发现天然生物活性多糖钙溶解性好，对胃肠道刺激小，不良反应低，能克服传统钙盐的缺点，是一类值得研究与开发的补钙剂[16]。为了更好地获得多糖螯合钙制剂，有研究者将多糖分子的羟基衍生化，引入强亲核原子或基团，常见含氮、磷或羧酸衍生物，从而在多糖分子链上引入强配体基团与钙离子产生稳定螯合[17]。

普鲁兰多糖是一种非离子链状多糖，其来源广泛，具有天然多糖的生物相容性和可生物降解性，同时具有良好的水溶性、黏性和成膜性特点[18]。此外，其分子链上的大量羟基可用于化学修饰，制备衍生物，引入功能基团，拓宽其应用范围。目前，将普鲁兰多糖及其衍生物应用于食品、保健品和药品等领域已获得研究者的 广泛关注[19]。本实验以天然普鲁兰多糖为原料合成羧甲基 普鲁兰多糖鳌合钙，用于治疗骨质疏松小鼠，为新型钙补充剂的开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

15～20 g清洁级Balb/C小鼠24 只，雌雄各半，由河北省实验动物中心提供（生产许可证号：SCΧK（冀）2018-004）。

普鲁兰多糖（2 000 kDa） 日本林原化学株式会社；羧甲基普鲁兰多糖（carboxymethyl pullulan，CMP）由实验室自制；氯化钙 北京惠宝联化科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FTIR-8400s傅里叶变换红外光谱仪 日本岛津仪器公司；T6紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；LGJ-18冷冻干燥机 宁波新芝仪器有限公司；TM3000扫描电子显微镜 日本日立仪器公司；AU680全自动生化分析仪 美国Beckman公司；YD-20KZ 硬度仪 天津天大天发科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CMP-Ca（II）的制备及表征

参考文献[20]合成CMP，经络合滴定法测得制备的CMP羧甲基取代度为40%。配制质量分数1%的CMP水溶液，50 ℃水浴条件下滴加CaCl2溶液，使Ca2+与CMP质量比为2∶1，用2 mol/L NaOH溶液调节反应液pH值至10。反应一定时间后，反应液以4 000 r/min离心5 min除去沉淀（直至无沉淀产生），取上清液，加入过量的2 mol/L Na2CO3溶液除去游离钙离子，4 000 r/min离心5 min。上清液减压浓缩后，加入无水乙醇进行醇沉，静置24 h后抽滤获得CMP-Ca（II）粗品，适量去离子水溶解，装入透析袋（截留分子质量8～12 kDa）中用蒸馏水透析后，将透析液冻干，得CMP-Ca（II）纯品。CMP和 CMP-Ca（II）样品用紫外光谱、傅里叶变换红外光谱和扫描电子显微镜进行表征。

1.3.2 紫外光谱分析

将CMP与CMP-Ca（II）分别溶于蒸馏水中，以蒸馏水为对照，采用紫外-可见分光光度计，在200～500 nm波长范围内进行扫描，分析两者扫描图谱的差异。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱分析

分别取干燥的CaCl2、CMP和CMP-Ca（II）样品，与KBr混合，研磨均匀后压片，用傅里叶变换红外光谱仪在4 000～400 cm-1范围内扫描，测定样品的红外吸收光谱。

1.3.4 扫描电子显微镜观察微观结构

采用扫描电子显微镜在真空条件下扫描CMP与 CMP-Ca（II）样品，电压为15 kV，放大倍数为100，观察样品的微观形貌特征。

1.3.5 CMP-Ca（II）配合物中钙离子质量分数测定

精密称定CMP-Ca（II）35 mg，置于烧杯中，加6 mol/L HCl 5 mL和蒸馏水30 mL溶解，煮沸5 min，冷却后转移至50 mL容量瓶中，定容，摇匀。精确量取5.0 mL样品溶液至锥形瓶中，用NaOH溶液调pH值至13～14，加1 滴钙紫红素指示剂，用0.05 mol/L的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液滴定至溶液由紫红色变为蓝色，即达到滴定终点。记录消耗EDTA溶液体积，按下式计算钙离子质量分数，平行测定3 次。

式中：cEDTA为EDTA滴定液浓度/（mol/L）；VEDTA为消耗EDTA溶液体积/mL；MCa为Ca的原子质 量/（g/mol）；m为待测溶液中CMP-Ca（II）的质量/mg。

1.3.6 CMP-Ca（II）配合物制备工艺优化

选取反应pH值（X1）、m（Ca2+）∶m（CMP）（X2）和反应温度（X3）为考察因素，以钙离子质量分数为评价指标，采用单因素试验考察3 个因素的影响，每个单因素试验平行操作3 次[21]。固定m（Ca2+）∶m（CMP） 为1∶1和温度为50 ℃，考察反应pH值分别为7、8、9、10、11和12时对CMP-Ca（II）配合物钙离子质量分数的影响；固定反应pH值为9和温度为50 ℃，考察m（Ca2+）∶m（CMP）为4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3时对CMP-Ca（II）配合物钙离子质量分数的影响；固定m（Ca2+）∶m（CMP）为1∶1和反应pH值为9，考察反应温度为30、40、50、60 ℃和70 ℃时对CMP-Ca（II）配合物钙离子质量分数的影响。依据单因素试验结果，设计3因素3水平的Box-Benhnken响应面试验[22]，按照表1优化反应条件。其中用1、0、-1代表自变量的高、中、低3 个编码水平，响应值Y为钙离子质量分数，进行17 次试验。用Design Expert 8.0软件对结果进行分析，获得 CMP-Ca（II）最佳制备的工艺条件并验证。

表1 Box-Benhnken响应面法因素水平表Table 1 Factors and levels used for Box-Benhnken design

1.3.7 骨质疏松Balb/C小鼠造模及CMP-Ca（II）体内评价

将15～20 g清洁级Balb/C小鼠随机分为3 组，每组8 只，雌雄各半，分别为空白对照组、模型对照组和CMPCa（II）组。在第1～14天，模型对照组和CMP-Ca（II） 给药组灌胃维甲酸70 mg/（kgmb·d），建立小鼠骨质疏松模型[23]，第15～42天，模型对照组灌胃生理盐水，CMP-Ca（II）给药组灌胃100 mg/（kgmb·d） CMP-Ca（II），空白对照组在1～42 d均灌胃生理盐水。实验期间各组小鼠分笼饲养，饲喂标准饲料，自由饮水，每天记录体质量。实验完毕后，小鼠断头取血，血液室温静置30 min，4 000 r/min离心10 min，分离血清置于4 ℃冰箱贮存。血清样本采用AU680全自动生化分析仪测定碱性磷酸酶（alkaline phosphatase protein，ALP）活力，通过偶氮砷III法测定血钙浓度。小鼠取血后，剥离其双侧股骨，剔除骨上附着组织，60 ℃烘至恒质量并称量，以股骨干质量/体质量来计算骨质量指数，游标卡尺测量其左侧股骨长度、宽度和厚度。通过排水法测定股骨体积，以股骨干质量/股骨体积计算骨密度。采用硬度仪测定股骨的骨硬度，记录最大承载力。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 CMP-Ca（II）制备工艺优化结果

采用单因素试验考察反应pH值、m（Ca2+）∶m（CMP） 和反应温度对钙离子质量分数的影响。由图1A可知，CMP-Ca（II）的钙离子质量分数随着pH值的增大先升后降。低pH值时，CMP分子中羧基解离度低，不利于与钙离子发生配合；pH 10时CMP-Ca（II）配合物中钙离子质量分数最高；pH＞10时，配合物中钙离子质量分数随着pH值的增大而降低，pH值增大可使溶液产生氢氧化钙沉淀，不利于CMP-Ca（II）配合物的合成。因此，选择pH 10为制备CMP-Ca（II）的最佳条件。 Ca2+与CMP二者的质量比也影响CMP-Ca（II）的钙离子质量分数，由图1B可知，在选定的比例下，随着m（Ca2+）∶m（CMP）减小，CMP-Ca（II）配合物钙离子质量分数先升高后降低，适宜的m（Ca2+）∶m（CMP）为2∶1。适当升高反应温度可提升反应物CMP与Ca2+之间的碰撞频率，促使产物生成。50 ℃时， CMP-Ca（II）配合物钙离子质量分数最高（图1C），若再提高反应温度，则CMP分子和Ca2+运动速度过快，限制了CMP分子上的配位基团与Ca2+的结合。

图1 pH值（A）、m（Ca2＋）∶m（CMP）（B）和反应温度（C） 对CMP-Ca（II）配合物钙离子质量分数的影响Fig.1 Effect of pH (A), m (Ca2＋)∶m (CMP) ratio (B) and temperature (C) on Ca2+ content of CMP-Ca(II)

参考单因素试验结果，设计3因素3水平的 Box-Benhnken响应面实验考察pH值（X1）、m（Ca2+）∶m（CMP）（X2）和反应温度（X3）对CMP-Ca（II）配合物制备工艺的影响，以钙离子质量分数（Y）为评价指标，结果见表2。各因素交互作用对钙离子质量分数影响的等高线和响应面图见图2。

表2 响应面法优化CMP-Ca（II）配合物制备工艺参数结果Table 2 Experimental design with results for response surface analysis

图2 各因素交互作用对钙离子质量分数影响的等高线和响应面图Fig.2 Contour plots and three-dimensional response surface plots describing the interactive effects of different factors on calcium content of CMP-Ca(II)

利用Design-Expert软件，得到回归方程：Y＝-166.179 5+31.145X1+4.329X2+0.614 75X3-0.01X1X2-0.006 5X1X3-0.005X2X3-1.531X12-0.981X22-0.005 36，其决定系数R2为0.999 3，模型方程拟合度良好；变异系数为0.46%，实验误差小，能准确地预测实际情况。回归方程失拟性检验P＝0.896 9＞0.05，符合模型要求，可利用该模型分析预测。经方差分析和统计学检验，模型的一次项X1、X2、X3，交互项X1X3、X2X3和二次项X12、X22、X32对CMP-Ca（II）复合物钙离子质量分数（Y）影响显著（P＜0.05），其中X1、X12、X22和X32影响高度显著（P＜0.000 1）。

为探讨各因素对制备CMP-Ca（II）配合物钙离子质量分数的影响，采用Design Expert软件绘制CMP-Ca（II） 中钙离子质量分数（Y）与反应pH值（X1）、m（Ca2+）∶m（CMP）（X2）和反应温度（X3）之间的等高线图和三维响应面图，考察X1、X2和X3对Y的影响。 图2A1和图2A2为反应pH值与m（Ca2+）∶m（CMP）交互作用对钙离子质量分数的影响，图2B1和图2B2为反应pH值与反应温度的交互作用对钙离子质量分数的影响，椭圆形等高线表示反应pH值与m（Ca2+）∶m（CMP）和反应pH值与反应温度对CMP-Ca（II）配合物钙离子质量分数有显著影响。图2C1和图2C2为m（Ca2+）∶m（CMP）与反应温度的交互作用对钙离子质量分数的影响，等高线稀疏且呈圆形，说明m（Ca2+）∶m（CMP）与温度对CMP-Ca（II）配合物钙离子质量分数影响不显著。采用Design Expert软件优选CMPCa（II）配合物的最佳制备条件为50 ℃、pH 10和m（Ca2+）∶m（CMP）＝2∶1。为验证模型可靠性，采用优化条件制备3 批CMP-Ca（II）配合物，获得的最高钙离子质量分数为10.3%，与模型方程预测值相一致。

2.2 CMP-Ca（II）的结构表征

CMP-Ca（II）配合物紫外光谱图如图3所示，CMP溶液在255 nm波长处显示出较强吸收峰，但CMP-Ca（II） 在200～400 nm波长处未见明显的紫外吸收，CMP在255 nm波长处的最大紫外吸收峰消失，表明CMP中的 —COOH与Ca2+发生络合，使得CMP-Ca（II）未见明显的羰基基团紫外吸收峰。

图3 CMP及CMP-Ca（II）配合物的紫外光谱Fig.3 UV spectra of CMP and CMP-Ca(II) complex

CMP-Ca（II）配合物傅里叶变换红外光谱分析结果见图4。CMP与CaCl2发生配合反应生成CMP-Ca（II），其红外光谱与CMP相比，—OH特征吸收峰由3 420 cm-1处 移至3 391 cm-1处，CMP-Ca（II）红外光谱曲线中CMP在1 732 cm-1处的羰基吸收峰消失，于1 600 cm-1处出现新的强吸收峰，证明成功合成CMP-Ca（II）配合物。CMP-Ca（II） 配合物合成过程中CMP的—OH和—COOH与Ca2+形成强配位键，导致CMP的羰基吸收峰消失。此外， CMP-Ca（II）的红外光谱图与CaCl2钙供体的红外光谱图存在显著不同，这与文献[21,24]报道的结果类似。

图4 CMP-Ca（II）傅里叶变换红外光谱图 Fig.4 FTIR spectra of CMP-Ca (II)

由图5可看出，CMP呈较为致密的层状结构，表明多糖分子间作用可形成重叠结构。而CMP与钙离子配合后，CMP-Ca（II）的结构发生根本改变，表面变为不规则的颗粒状，说明CMP与金属离子配合时其糖链发生不同程度的卷曲，配位键的形成极大改变了多糖结构，配位前后表面形貌发生了显著的变化[25]。

图5 CMP（A）和CMP-Ca（II）（B）扫描电子显微镜图 Fig.5 SEM images of CMP (A) and CMP-Ca(II) (B)

2.3 CMP-Ca（II）治疗小鼠骨质疏松效果的初步评价

体质量是反映生物体健康状况的重要指标，经维甲酸及CMP-Ca（II）制剂干预后小鼠体质量的变化如图6所示。模型对照组小鼠4 d后体质量持续下降，而生理盐水灌胃的空白对照组小鼠体质量正常增长（图6A），说明维甲酸对小鼠的生长影响显著。维甲酸灌胃3 d后，小鼠摄食量、活动量均明显减少，反应迟钝，蜷缩成团，可见被毛枯槁乍起、眼鼻部及耳部黏膜红肿发炎、后腿站立不起等变化。14 d后处死小鼠，比较发现空白对照组小鼠股骨光滑，骨骼关节发白发亮，未发现自发性骨折，而维甲酸模型对照组股骨表面略显粗糙，有肉眼可见骨质缺失，骨骼关节发黑发暗（图7A）。摘取空白 对照组与模型对照组小鼠的心、肝、脾、肺和肾，肉眼观察未见两组小鼠脏器的大小、形态的异常改变，表明给予70 mg/（kgmb·d）维甲酸建立小鼠骨质疏松模型成功。图6B是CMP-Ca（II）组和空白对照组小鼠在28 d内体质量的变化情况。初始时，空白对照组小鼠体质量明显高于模型组，基本维持在25 g左右。随着补充 CMP-Ca（II），CMP-Ca（II）组小鼠的体质量呈现快速上升趋势。表明灌胃一定剂量的CMP-Ca（II）在小鼠自身生长过程中可参与营养骨骼并促进小鼠生长。

图6 不同组别的Balb/C小鼠体质量变化Fig.6 Body mass variation of Balb/C mice in different experimental groups

图7 空白对照组（A）与模型对照组（B）小鼠股骨形态图Fig.7 Appearance of femur in normal (A) and model (B) mice

骨质疏松早期无明显症状，通常以测定骨密度来初步判断是否骨质疏松[26-27]，但仅凭骨密度不能反映骨强度，如患有石骨病时患者骨密度虽正常，但该病引起的骨折发生率却很高，故除骨密度外，骨硬度也是反映骨是否正常的重要指标[28]。另外，骨质量与骨结构紧密相关，股骨干质量、股骨钙含量变化等也被作为评价补钙制剂效果的指标[29]。为全面反映骨骼生长情况，对空白对照组、模型对照组和CMP-Ca（II）给药组小鼠股骨指标、骨密度、骨硬度、血钙浓度、ALP活力进行了测定，结果如表3所示。与空白对照组相比，模型对照组 小鼠的股骨长度、宽度、厚度、干质量和骨质量指数均显著降低，骨密度和骨硬度均显著减小（P＜0.05），说明维甲酸灌胃对小鼠的骨骼发育产生了明显影响。动物体内99%以上的钙沉积于骨骼与牙齿中，正常生物体血钙含量低，且与骨钙含量维持动态平衡，但骨质疏松可促使骨钙溶出，导致血钙含量升高。此外，骨质疏松时，血液中ALP活力会明显升高。故测定骨代谢的血钙浓度和ALP活力对骨质疏松症等代谢性骨病的诊断具有重要意义[30]。由表3可知，维甲酸使得模型对照组ALP活力显著升高，表明模型小鼠破骨细胞的活性依旧较强。但血钙浓度与空白对照组无显著差异，这可能与长期停用维甲酸后小鼠自身稳态调节有关。上述结果表明，模型对照组小鼠骨骼处于负钙平衡状态，骨质疏松倾向明显，说明造模成功。与模型对照组相比，CMP-Ca（II）组小鼠股骨长度并未增加，表明成年小鼠钙质的补充并不能增加骨长，但小鼠股骨的宽度、厚度、干质量和骨质量指数均有不同程度的增加，说明CMP-Ca（II）对提高骨质量有明显效果，主要是通过增加骨横径及骨质量实现；此外，CMP-Ca（II）组小鼠股骨的骨密度、骨硬度较模型对照组均有不同程度的改善，ALP活力下降，说明 CMP-Ca（II）可抑制骨破坏并调节骨重建，具有一定改善维甲酸导致的骨质疏松作用。

表3 不同小鼠不同指标的测定结果Table 3 Measured bone indexes of mice in different groups

3 结 论

本实验采用单因素试验和Box-Benhnken响应面实验优化条件，制备了钙离子质量分数为10.3%的 CMP-Ca（II）。CMP-Ca（II）与CMP相比，紫外光谱和傅里叶变换红外光谱图差异明显，CMP-Ca（II）的紫外光谱中255 nm波长处最大吸收峰消失，而在红外光谱中于1 600 cm-1处出现新的吸收峰，证明CMP-Ca（II） 配合物成功合成。扫描电子显微镜观察结果显示， CMP-Ca（II）产物为粒状结构。采用维甲酸构建骨质疏松小鼠模型，以CMP-Ca（II）配合物为补钙剂，验证其对骨质疏松小鼠补钙效果。经过28 d干预，CMP-Ca（II）可提高骨质量，其中，以增加骨横径及骨质量为主，此外CMP-Ca（II）还可改善骨密度、骨硬度，具有一定改善维甲酸导致的骨质疏松作用。