维甲酸联合胆汁酸对结肠癌细胞增殖、抑制凋亡的影响及初步机制研究

曾国祥　王琦　熊娟

[摘要] 目的 探讨维甲酸联合胆汁酸对结肠癌细胞增殖、抑制凋亡的影响及初步机制。 方法 选用不同浓度的维甲酸及脱氧胆酸钠，分别或联合作用于人结肠腺癌HT-29细胞，检测细胞的增殖以及抑制凋亡情况。 结果 维甲酸联合胆汁酸可以有效抑制HT-29细胞的生长，诱导细胞凋亡，效果优于单独应用（P<0.05）。 结论 维甲酸联合胆汁酸能够抑制结肠癌细胞增殖，且抑制凋亡的程度与浓度相关，能够为结肠癌的治疗提供参考。

[关键词] 维甲酸；胆汁酸；结肠癌；细胞增殖；抑制凋亡

[中图分类号] R735.35 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）01-0008-03

结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率在我国仅次于胃癌和食道癌，居消化道恶性肿瘤的第3位。随着我国居民生活质量以及饮食结构的变化，结肠癌的临床发病率越来越高。肠腔内部微环境的变化同结肠癌发病之间的联系受到人们的重视，并且研究人员发现该病的发生发展同动物脂肪的摄入存在联系，推测原因是高脂饮食会加大肠腔内部的脱氧胆酸，脱氧胆酸作为胆汁酸的一种，能够通过诱发细胞DNA的损伤而诱导结肠癌出现[1]。维甲酸（ATRA）有着广泛抗肿瘤增殖的活性，能够降低结肠癌细胞的耐药性，不过大剂量使用的毒副作用较为明显，这就需要探索联合用药抑制细胞增殖的小剂量ATRA。本研究分析ATRA联合胆汁酸脱氧胆酸对结肠癌细胞增殖以及凋亡的影响，探讨其可能的作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

结肠癌细胞株为SW116，细胞培养瓶以及培养板为Nuck公司生产，培养基以及MTT为Promaga公司生产，小牛血清为杭州四季清公司生产，脱氧胆酸为上海华美公司生产，兔抗人COX-2抗体为Neomarkers公司生产，ATRA为sigma公司生产，酶标仪型号为Elx800。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养以及药物准备 肿瘤细胞在培养时选用胎牛血清培养液，条件设置方面，温度37℃，CO2 5%，湿度100%，培养细胞1 d到对数生长期，在弱光条件下换液后进行实验[2]。使用100 mg的ATRA加入乙醇当中配成10 mmol/L的母液，在-20℃条件下避光储存。实验所需要的ATRA使用培养液进行稀释，且全部实验均需要重复3次进行细胞培养。HT-29细胞培养使用RPMI-1640溶液，添加胎牛血清、链霉素以及青霉素，37℃条件下传代培养，每天观察细胞的生长状况[3]。

1.2.2 MTT实验 取对数生长期HT-29细胞接种到96孔板，每孔10 000。细胞贴壁1 d之后按组别添加浓度10、50、100 μmol/L的ATRA，每孔20 μL，每组共5个复孔，持续培养24 h、48 h或72 h，在反应终止前吸去培养液，并加入RPMI-1640培养基，孵箱内3 h之后弃上清，使用异丙醇100 μL溶解结晶振荡10 min之后应用酶标仪读取值[4]。

1.2.3 细胞周期以及细胞凋亡 HT-29细胞根据5×105/mL接种到6空板，每孔3 mL，1 d之后按组别加入不同浓度的脱氧胆酸，每孔3 mL，每组设置5个复孔。作用1 d之后收集贴壁以及悬浮的细胞，根据说明书使用细胞仪进行检测[5]。

1.2.4 免疫细胞染色 HT-29细胞根据5×105/mL接种到6空板，每孔3 mL，在1 d之后分别加入不同浓度的脱氧胆酸，每组设置3个复孔。作用1 d之后终止反应并吸去培养液。使用冷丙酮进行10 min固定，PBS反复进行3次冲洗，滴加100 μL的兔抗人COX-2抗体，5℃冰箱储存，第2天使用PBS反复进行3次冲洗，滴加100 μL羊抗兔IgG-HRP，并37℃孵育1 h，PBS反复进行3次冲洗之后DAB显色，脱水，透明，使用树胶封片[6]。

1.3 判断标准

结果判定方面，COX-2及caspase-3染色定位到细胞质。PARP-1染色定位到细胞核，其中阳性物质为棕黄色或黄色的颗粒。每张玻片选取3个视野（×400），每个视野统计100个细胞，由病理科医师使用相关软件来测定三者的密度值之后取均值[7]。

1.4 统计学方法

检测数据用SPSS18.0软件进行分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度/时间ATRA对结肠癌细胞增殖的抑制率

不同浓度/时间的ATRA对于细胞增殖有明显的抑制作用，8 μmol/L的ATRA在作用72 h之后对肿瘤细胞的抑制效果显著优于24 h以及48 h（P<0.05），见表1。

2.2 ATRA联合脱氧胆酸对HT-29细胞周期和细胞凋亡的影响

流式细胞仪的分析结果表明，10 μmol/L的脱氧胆酸联合8 μmol/L的ATRA作用HT-29细胞24 h，能够增加HT-29细胞的凋亡，同时细胞周期阻滞在G0/G1期，并且S期细胞明显减少（P<0.05），见表2。

2.3 ATRA联合脱氧胆酸对HT-29细胞COX-2、PARP-1及caspase-3表达的影响

免疫细胞化学染色和光密度分析结果显示，ATRA联合脱氧胆酸可以有效抑制HT-29细胞的生長，显著优于单用ATRA或单用脱氧胆酸，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

3结论

肿瘤可以说是多种基因改变诱发的细胞增殖，使得细胞周期的调控出现问题，导致细胞出现异常分化。细胞周期控制点以及蛋白表达的失控可以说是肿瘤增生的一个重要影响因素。ATRA能够诱导细胞分化以及逆转功能，推测起作用途径在于癌细胞ATRA受体互相作用或借助于抑制细胞表面的黏附蛋白而发挥影响。近年研究结果显示，ATRA能够诱导小鼠的胚胎癌细胞进一步分化成为纤维母细胞或内皮细胞，同时也能够分化成熟超过90%的人类白血病细胞株，同时体现出成熟细胞的功能以及形态[8]。在接种不同浓度的ATRA来处理肺癌细胞株到Boyden小室之后，癌细胞的侵袭功能显著下降，并且同接种的浓度存在直接的联系。这意味着ATRA有着影响癌细胞运动以及抑制癌细胞粘附的效果。

有研究报道经过ATRA处理之后的胃癌细胞株在接种到裸鼠之后，同未接种的裸鼠比较，接种裸鼠的肿瘤生成率及直径均显著下降。电镜观察结果显示细胞形态从椭圆形、大核、周边凹陷改变为长椭圆形、小核以及核周边光滑，同时癌细胞的G0/G1百分比上升，S期以及M期的百分比明显下降，意味着ATRA对实体瘤能够发挥一定的治疗效果[9]。本研究的结果显示，ATRA对体外结肠癌细胞的增殖能够发挥明显的抑制效果，抑制癌细胞增殖并加速癌细胞的分化，同时抑制强度同ATRA的浓度存在着正相关关系[10]。TRA能够借助于诱导癌细胞当中的线粒体基因来调控肿瘤细胞逆转与分化。ATRA一方面对白血病能够发挥理想的治疗效果，另一方面能够借助于干预多种不同的肿瘤细胞因子，来控制细胞增殖[11]。本研究的结果显示，ATRA对于体外结肠癌细胞的增殖有着明显的抑制效果，并且同ATRA浓度存在正相关，ATRA的浓度越高，抑制效果就越为显著（P<0.05）。需要注意的是，本研究并未直接观察ATRA对实体瘤直接的作用，要想确定ATRA对于结肠癌治疗的效果，还需要在后续的研究中观察ATRA对于实体瘤细胞以及结肠癌患者的效果。

COX-2在不同类型的肿瘤组织当中都存在过表达，同结肠癌出现及恶化有着密切的联系。抑制COX-2能够下调周期调节蛋白的表达，并可以上调caspase-3的表达，阻滞细胞的周期从而诱导细胞的凋亡[12]。常见的细胞凋亡路径包括细胞内凋亡以及细胞外凋亡，后者主要是激活死亡受体并且活化caspase-3，前者主要是借助于线粒体释放色素来活化caspase-3，从而裂解PARP-1让其丧失修复DNA的作用，加速肿瘤细胞的凋亡[13]。本研究结果提示，脱氧胆酸能够借助于调高COX-2蛋白的表达而加速结肠癌细胞的增殖（P<0.05）。有研究人员发现PARP-l抑制剂对于人肝癌细胞株的生长能够发挥抑制效果，但在存在脱氧胆酸的条件下是否可以发挥这一效果还不确定。本研究的结果显示，脱氧胆酸可以加速结肠腺癌HT-29菌株的增殖，提高COX-2及PARP-1的表达，降低caspase-3的表达，这表明经过脱氧胆酸的作用之后，一方面可以损伤HT-29菌株的细胞DNA，从而调整PARP-1表达并修复DNA，另一方面可以借助于诱导COX-2表达而控制细胞色素，尤其是caspase-3的活性，最终抑制细胞的凋亡[14]。这可以说是脱氧胆酸刺激HT-29细胞增殖的一个影响因素。脱氧胆酸同ATRA联合作用于HT-29细胞之后，可以抑制脱氧胆酸对HT-29菌株细胞的增殖效果，从而阻滞细胞的周期并诱导细胞凋亡，降低COX-2以及PARP-1蛋白的表达。脱氧胆酸损伤DNA之后需要PARP-1进行修复，而ATRA作为PARP-l的抑制剂可以降低PARP-1的活性，使得其无法同DNA的缺口进行结合，从而丧失修复损伤的作用，诱导肿瘤细胞凋亡。除此之外，有研究人员认为二者连用能够抑制HT-29同内皮细胞之间的黏附，联系本研究当中COX-2表达同PARP-l表达之间的一致性，推测二者之间存在联系[15]。

综上所述，ATRA联合胆汁酸能够抑制结肠癌细胞的增殖，同时其抑制凋亡的程度同浓度相关，能够为结肠癌的治疗提供参考。

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（收稿日期：2016-06-26）