白芍总苷对脑缺血再灌注大鼠缺血区神经元再生的保护作用

李雪晶，牛玉秋，吕斯琦

脑卒中是导致人类残疾死亡的常见病，脑卒中的首选治疗方式为溶栓，但缺血区恢复血供常造成二次损伤，病人痊愈后仍伴有严重神经功能障碍[1]。其机制可能为脑缺血再灌注造成中枢神经系统损伤，导致神经元凋亡。神经细胞损伤同时激活人体神经元再生功能[2]。成年动物脑中，前脑管膜下区(SVZ)和海马齿状回颗粒层下区(SGZ)是神经再生的发生区。生理条件下，成年动物齿状回SGZ的新生神经元迁移至齿状颗粒层分化成熟，SVZ迁移至嗅球。病理情况下，新生神经元除了正常迁移外，可向脑损伤部位发生迁移，并与损伤部位神经元有效整合。因此，神经元再生是恢复神经功能障碍和学习认知损伤的重要途径[3]。有研究显示，白芍总苷在改善神经退行性疾病具有重要的药理作用[4]。本研究采用中动脉脑缺血再灌注(MCAO)模型探讨白芍总苷改善大鼠缺血区神经元再生的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与给药 将40只无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠(辽宁中医药大学实验动物中心提供)适应性喂养1周后，进行中动脉缺血再灌注造模，造模后随机分为假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注组(MCAO组)、白芍总苷组(TGP200mg/kg)、白芍总苷+抑制剂组(TGP+PD173074 组，TGP 200 mg/kg+PD173074 2 mg/kg)，每组10只。连续灌胃14 d给予白芍总苷，腹腔注射抑制剂PD173074，Sham组与MCAO组给予等量生理盐水，期间进行行为学训练与测定。MCAO组与TGP组部分大鼠处死前3 d连续腹腔注射50 mg/kg的 5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)用于免疫荧光染色中标记分裂细胞。

1.2 实验材料 圆头尼龙线栓(广州佳灵生物公司)；异氟烷(北京一品制药公司)；2，3，5-三苯基四唑氯铵(TTC溶液，广州鸿洲科技公司)；白芍总苷(西安开来生物科技公司)；PD173074(阿拉丁生物公司)；BrdU标记物(美国Sigma公司)；血管内皮生长因子(VEGF)抗体、神经元核抗原抗体(NeuN)、双皮质素(DCX)抗体、BrdU抗体(美国Abcam公司)；脑源神经元营养因子(BDNF)抗体，细胞质膜微囊蛋白-1(Caveolin-1)抗体，β-肌动蛋白(β-actin)抗体(武汉三鹰生物公司)；2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠(BCA)蛋白定量试剂盒、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液(上海碧云天生物公司)。

1.3 脑缺血再灌注模型 参考文献[5]造模方式，中动脉脑缺血手术前使用0.5%～1.0%异氟烷(0.4 L/min)对大鼠进行吸入式麻醉，完全麻醉后仰卧固定于泡沫板上，颈部切一个1.5 cm的伤口，在不损伤肌肉与神经情况下分离左侧颈总动脉、颈内动脉与颈外动脉。止血夹固定颈总动脉与颈内动脉，在颈外动脉剪开一个微小伤口，自伤口插入一根圆头尼龙线栓，缓慢前进至颈内动脉内约1 cm。脑缺血2 h后，再次麻醉大鼠，取出线栓，恢复颈内动脉血液供给。手术期间，给予大鼠37 ℃保温箱进行保温。术后持续给予分组药物治疗，并在术后第1天、第7天、第14天测定神经功能。

1.4 神经功能评估 大脑受损后第1天、第7天、第14天应用神经学评分系统以Zea Longa标准对所有大鼠神经功能进行测评：0分为无神经系统缺陷和正常肢体运动；1分为无法完全伸展右前肢；2分为向一侧偏瘫盘旋；3分为向一侧跌倒偏瘫；4分为无运动或自发行走和意识障碍；5分为死亡。

1.5 八臂迷宫测试 采用八臂迷宫设备评定空间学习记忆能力。设备中央为直径22 cm的八角形竞技场，具有8个辐射臂，每条辐射臂长30 cm、宽10 cm，距地面100 cm。正式进行八臂迷宫训练前，所有大鼠限制性喂食，以刺激在迷宫中觅食速度。训练过程中，将食物诱饵放置于手臂末端的容器中，间隔放置。将大鼠分别放置于迷宫中央，自由或诱导寻找食物，并记录运动轨迹。术后治疗1 d开始训练，每日训练2次，共5 d。测试期间，大鼠进入手臂吃光所有食物或经过5 min的最大时限，测试结束。工作记忆错误：重新访问前先用食物诱饵访问过的手臂次数；参考记忆错误：进入食物诱饵的手臂。上述信息可评估大鼠长期记忆、学习能力。

1.6 动物取材 最后一次神经功能得分评估结束后，各组取6只大鼠采用水合氯醛深度麻醉后，使用生理盐水进行心脏灌流，迅速取出大脑组织，4 ℃条件下，3只置于生理盐水中，3只置于4%多聚甲醛中储存备用。剩余大鼠经水合氯醛深度麻醉后，迅速断头取脑，分离出海马组织，-20 ℃冰箱中储存备用。

1.7 脑梗死体积评估 取出生理盐水中的大脑组织，置于-20 ℃冰箱中冰冻10 min。对冰冻脑组织进行切片处理，切成4片，快速置于2%TTC溶液中，暗环境条件下，37 ℃孵育30 min，使用4%多聚甲醛溶液固定10 min。使用Image Pro Plus 6.0图像分析仪测量并计算脑梗死面积和脑体积(对侧半球体积-同侧非梗死体积/对侧半球体积)。

1.8 免疫荧光双染测定神经元再生情况 取出多聚甲醛溶液中的脑组织，在蔗糖溶液中梯度脱水24 h。用冰冻切片机将脑组织切成20 μm组织片，收集组织片置于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。对BrdU和DCX/NeuN进行双重免疫荧光染色。将组织切片使用PBS洗涤，浸入含10%驴血清和0.3%Triton X-100的PBS溶液中1 h，与抗DCX抗体、抗NeuN抗体在4 ℃孵育过夜。室温下，将切片在二抗溶液中孵育1 h。BrdU免疫染色，将切片在2 mol/L HCl中于37 ℃孵育30 min以使DNA变性，并使用0.1 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.4)中和10 min。PBS洗涤后，将切片与0.1%胰蛋白酶在37 ℃下孵育5 min，之后在含有10%驴血清和0.3%Triton X-100的PBS溶液中孵育10 min。将切片与大鼠抗BrdU抗体在4 ℃孵育过夜，之后使用PBS洗涤，并与驴抗大鼠抗体在室温孵育1 h。将所有切片洗涤，使用带有4′，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)防荧光猝灭试剂滴加在载玻片上，采用免疫荧光显微镜系统拍摄荧光照片，通过Image Pro Plus软件分析平均荧光强度作为最终统计结果 。

1.9 免疫印迹法(Western Blotting)测定神经元各蛋白表达情况 取出海马组织，将RIPA裂解液按体积质量比5 μL∶1 mg加入组织中并研磨匀浆10 min，4 ℃条件下再静置裂解30 min。高速冰冻离心机4 ℃条件下12 000 r/min离心30 min。取上清液，以BCA试剂盒测定蛋白浓度，以蛋白量10 μg进行上样，采用SDS-PAGE凝胶电泳，经转膜、封闭、一抗抗体孵育、二抗抗体孵育。条带洗净后，均匀添加发光液，显影仪显影后使用Image J软件进行灰度值分析。

2 结 果

2.1 白芍总苷对MCAO大鼠神经功能评分和脑梗死体积的影响 术后第7天及第14天，与MCAO组比较，TGP组神经功能评分减小(P<0.05)。术后第14天，与TGP组比较，TGP+PD173074组神经功能状态无改善(P>0.05)。术后第14天，除Sham组，各组大鼠出现不同程度的脑梗死，其中MCAO组脑梗死严重。与MCAO组比较，TGP组梗死面积缩小(P<0.05)；与TGP组比较，TGP+PD173074组梗死面积增加(P<0.05)。提示本研究中脑缺血再灌注造模成功，MCAO组大鼠神经功能损伤，出现大面积梗死，白芍总苷改善作用显著，但VEGF抑制剂PD173074部分逆转白芍总苷对神经功能损伤和局部脑梗死的改善。详见表1、图1。

表1 白芍总苷对MCAO大鼠神经功能评分的影响(±s) 单位：分

与MCAO组比较，＊P<0.05；与TGP组比较，△P<0.05。

2.2 白芍总苷对脑缺血后空间学习记忆能力的影响 手术后14 d，与Sham组比较，MCAO组大鼠错误次数增加(P<0.05)。TGP治疗后，大鼠行为错误次数降低，其中工作错误次数降低。VEGF抑制剂干预增加大鼠错误次数。详见图2。

与Sham组比较，#P<0.05；与MCAO组比较，＊P<0.05。

2.3 白芍总苷对MCAO大鼠Caveolin-1/VEGF信号通路和BDNF蛋白的影响 与Sham组比较，Caveolin-1和VEGF表达升高；与MCAO组比较，TGP+PD173074组Caceolin-1和VEGF表达升高(P<0.05)。PD173074除了抑制VEGF表达，减少了Caveolin-1和BDNF表达升高。详见图3。

a为Sham组；b为MCAO组；c为TGP组；d为TGP+PD173074组。与MCAO组比较，＊P<0.05；与TGP组比较，△P<0.05。

2.4 白芍总苷对MCAO大鼠BrdU+/DCX+免疫阳性细胞数量的影响 DCX是一种微管相关蛋白，可特异性地表达于由神经干细胞分化而成的神经前体细胞和处于迁移状态的未成熟神经元，是一个神经再生标记物[6]。与MCAO组比较，TGP组齿状回区域含有较多的BrdU免疫阳性细胞和DCX免疫阳性细胞。免疫双染(Merge)显示，两组BrdU+/DCX+免疫阳性细胞数量比较差异有统计学意义(P<0.05)。与MCAO组比较，TGP组大鼠海马DCX总蛋白表达升高(P<0.05)。与TGP组比较，VEGF抑制剂PD173074显著降低DCX总蛋白表达(P<0.05)。详见图4、图5。

图4 BrdU+/DCX+免疫双染

与MCAO组比较，＊P<0.05；与TGP组比较，△P<0.05。

2.5 白芍总苷对MCAO大鼠BrdU+/NeuN+免疫阳性细胞数量的影响 与MCAO组比较，TGP组大鼠海马BrdU+/NeuN+免疫阳性细胞数量增加。与MCAO组比较，TGP组大鼠海马NeuN总蛋白表达升高(P<0.05)。与TGP组比较，VEGF抑制剂PD173074显著降低了NeuN总蛋白表达(P<0.05)。提示TGP可增加缺血后海马齿状回区域海马神经元新生。详见图6、图7。

图6 BrdU+/NeuN+免疫双染

a为Sham组；b为MCAO组；c为TGP组；d为TGP+PD173074组。与MCAO组比较，＊P<0.05；与TGP组比较，△P<0.05。

3 讨 论

脑损伤和神经变性机制与神经血管单位中多种细胞相互作用有关，神经细胞单位是由周细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元和基底层组成。脑缺血/再灌注引起的神经血管单位破坏导致血脑屏障损伤，神经元死亡或变性，神经胶质反应和免疫细胞浸润[7]。有研究显示，白芍总苷在脑缺血再灌注损伤恢复过程中具有良好的药理作用[8]。白芍总苷是否可促进血管生成和神经发生并补偿缺血性脑损伤，关于促进认知、记忆功能恢复的研究较少。因此，本研究探讨白芍总苷促进血管生成和神经发生的作用机制。

脑缺血再灌注成功造模大鼠出现脑部梗死，神经功能评分降低，空间记忆能力损伤的症状。本研究结果显示，白芍总苷可减少MCAO大鼠梗死体积和神经功能评分，恢复大鼠记忆功能。对于TGP+PD173074组大鼠，存在VEGF抑制剂的情况下，白芍总苷不能减少梗死体积、改善神经功能和空间记忆能力。通过Western Blotting测量Caveolin-1、VEGF和BDNF表达水平。结果显示，白芍总苷显著上调Caveolin-1、VEGF和BDNF表达水平。PD173074在MCAO后第14天对这些蛋白质表达有负面影响。提示Caveolin-1/VEGF途径可能是缺血性损伤后白芍总苷介导过程中的信号途径之一。

有研究显示，丹参酮ⅡA部分通过MARK42/44介导BDNF和神经生长因子(NGF)信号增强神经元分化，活化的Caveolin-1具有促进丹参酮ⅡA跨细胞膜转运触发神经元分化的作用，且Caveolin-1敲除导致神经元分化停止[9]。另有研究显示，BDNF有利于脑缺血后神经元蛋白特异性上调，突触发育和神经认知功能改善[10]。通过腺病毒转染VEGF蛋白移植到缺血大鼠脑梗死区，检测到VEGF和BDNF表达持续增加，从而改善大脑微血管密度和神经元凋亡[11]。BDNF通过激活多数内皮细胞的激活受体，对调节血管发育、应对损伤的反应均具有重要的作用。有研究显示，BDNF诱导的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和脑源性神经营养因子受体(TrkB)活化可能介导内皮存活，从而促进血管生成[12]。本研究中MCAO大鼠中使用白芍总苷和VEGF抑制剂的情况下，TGP组海马BDNF表达升高，而TGP+PD173074组BDNF表达降低，并造成脑梗死和神经功能恢复受损。提示Caveolin-1和VEGF均与BDNF有关，且白芍总苷通过Caveolin-1/VEGF信号通路增强脑缺血后血管新生过程，而BDNF是协同血管修复中重要的因素之一。

相关研究显示，脑出血、脑梗死等缺血性疾病早期对海马区神经发生具有抑制作用，随着脑血管痉挛逐渐缓解，3 d后神经再生区功能逐渐恢复并表现为代偿性功能上调[13]。神经再生中海马区神经再生发生于SGZ，是神经再生重要的组成部分。中动脉闭塞后诱导脑血管痉挛，造成脑组织缺血，各种缺血因子表达上调，作用于SGZ神经元再生，增强该区神经元功能再生功能，SGZ新生神经元迁移至颗粒细胞层并分化为成熟神经元[14]。BrdU作为一种胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶作为原料参与DNA复制过程，测定DNA复制活性并准确地反映细胞增殖情况[15]。本研究结果显示，白芍总苷治疗14 d后，与Sham组比较，大脑BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+双标记细胞增加，且DCX与NeuN总蛋白水平均升高，而VEGF抑制剂引起两种蛋白表达降低，提示白芍总苷增强海马齿状回区神经再生，而VEGF抑制剂部分逆转了白芍总苷促进神经再生的功能。

综上所述，白芍总苷通过Caveolin-1/VEGF信号通路改善大脑海马BDNF水平，促进海马齿状回SGZ神经元再生，缓解缺血再灌注大鼠神经功能损伤，减少缺血侧脑梗死，改善学习记忆功能。