咪达唑仑对2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤、氧化应激和炎症反应的影响

2021-08-31李前辉郭浩翔谢小娟张宜林

中西医结合心脑血管病杂志 2021年16期

李前辉，郭浩翔，谢小娟，张宜林

糖尿病心肌病是糖尿病的一种主要心血管并发症，引起心力衰竭，并最终导致糖尿病病人死亡率增加[1]。糖尿病病人心脏对再灌注损伤敏感性和预后较非糖尿病病人更差[2]。有研究显示，糖尿病可消除各种药物或缺血预处理对缺血心肌的保护作用[3]。因此，了解糖尿病心肌缺血再灌注损伤发病机制及发现新型预防药物极其重要。在心脏病学中，咪达唑仑可作为心脏外科手术和心肌灌注诊断和治疗程序之前的麻醉前药物，已有研究显示，咪达唑仑对心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用[4]，但咪达唑仑对2型糖尿病心肌缺血再灌注的作用尚不明确。有研究显示，炎症反应和氧化应激增加是诱导糖尿病心脏再灌注损伤的主要因素[5]。本研究观察咪达唑仑对2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤、炎症反应和氧化应激的影响，以期为2型糖尿病心肌缺血再灌注损伤的预防提供基础医学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂咪达唑仑注射液(宜昌人福药业有限责任公司生产，批号：180305)，苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(上海研瑾生物，货号：J-SG1120-10)，肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB，CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、心肌肌钙蛋白I(cardiactroponin I，cTnI)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒(上海联硕生物科技有限公司，货号：ml002220、ml042664、ml042326、ml042384、ml010129、ml042383、ml059476、ml037361、ml002859)，Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京碧波生物科技有限公司生产，BA11100)，2，2联喹啉-4，4-二甲酸二钠(BCA)试剂盒(上海易色医疗科技有限公司生产，货号：BC201)，放射免疫沉淀(RIPA)裂解缓冲液(南京海克尔生物科技有限公司生产，货号：SBJ-0999)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔单克隆二抗、核因子E2相关因子2(Nrf2)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化还原酶-1(NQO-1)、血红素氧合酶-1(HO-1)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(GAPDH)兔来源的单克隆一抗(英国Abcam公司，货号ab6721、ab92946、ab28947、ab13243、ab9485)。

1.1.2 实验动物选取48只雄性Wistar大鼠，体重160～180 g，年龄8～9周，购自四川夏派森医药科技有限公司，许可证号：SYXK(川)2017-203。将大鼠随机分为对照组和糖尿病组，各24只。所有大鼠在湿度为(50±10)%、温度为(22±3)℃、14 h/10 h明暗的环境中饲养，自由获取食物和饮水至少1周，再用于实验。本研究中实验动物已得到批准，所有程序均符合该机构的道德标准，并按照医院动物护理和使用委员会的指导进行。

1.1.3 实验仪器 microopticon 荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测系统购自美国Bio-Rad公司；FDP-1 HRV & BRS分析系统购自中国上海嘉龙教仪厂；美国碧迪流式细胞仪FACS Calibur(美国碧迪医疗器械有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 通过高脂饮食和链脲佐菌素(strepozotocin，STZ)方法诱导大鼠2型糖尿病适应饲养1周后，给予观察组24只雄性Wistar大鼠高脂饮食(标准普通食物67.5%，蔗糖20%，猪油10%和蛋黄粉2.5%)和10%糖水喂养5周。通过每日2次腹膜内注射30 mg/kg剂量的STZ(溶于0.1 mmol/L柠檬酸盐缓冲液，pH 4.2)治疗大鼠。3 d后，从尾静脉提取血液样品测量血糖水平。血糖>16.7 mmol/L证实该鼠患糖尿病。对照组大鼠喂食常规饮食，并单独注射柠檬酸盐缓冲液。

1.2.2 分组及给药将24只糖尿病大鼠随机分为糖尿病假手术组(DS组)、糖尿病心肌缺血再灌注组(DI/R组)、糖尿病心肌缺血再灌注给药组(DI/RM组)；将对照大鼠，将24只健康Wistar雄性大鼠再随机分为假手术组(sham组)、心肌缺血再灌注组(I/R组)、心肌缺血再灌注给药组(I/RM组)。缺血给药前20 min，I/RM组和DI/RM组大鼠静脉注射咪达唑仑0.75 mg/kg，并以1 mg/(kg·h)微注射泵维持至再灌注结束[6]。

1.2.3 心肌缺血再灌注大鼠模型参考文献[7]，除sham组和DS组外，其余大鼠腹膜内注射戊巴比妥钠60 mg/kg麻醉，之后将大鼠固定于右侧卧位，采用1%聚乙烯碘对胸部和腹部进行消毒，并使用无菌洞巾覆盖大鼠。通过微注射泵注射咪达唑仑，于左侧第4肋间切开后进行心包切开术，将5-0眼科缝合线置于左冠状动脉的前降支周围，完全结扎冠状动脉以获得局部缺血。若手术成功，则在闭塞远端的心肌出现浅色。缺血30 min后，通过释放结扎线恢复血流，通过目测检查鲜红色血液返回确认缺血区域的再灌注。sham组和DS组大鼠进行相同的外科手术，但不结扎左冠状动脉的前降支。

1.2.4 FDP-1 HRV和BRS分析系统测定心功能 I/R手术后，麻醉大鼠，并通过右颈总动脉向左心室插管。通过MFLab 3.01软件包在FDP-1 HRV和BRS分析系统测定左室舒张末期压(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、心率(heart rate，HR)和冠状动脉流量(coronary flow，CF)，监测心脏功能。

1.2.5 ELISA检测血清CK-MB、LDH、cTnI、TNF-α、IL-6、IL-1β和心肌组织MDA、GSH、SOD的表达水平收集血样，6 h后离心；选取心脏同一部位组织，按质量体积比为1∶9加入生理盐水匀浆，离心后取上清液加入各反应孔，37 ℃反应45 min。使用洗涤液洗涤4次，再加入生物素标记抗体，37 ℃孵育30 min；洗涤后加入HRP标记的链霉亲和素混合均匀，37 ℃反应30 min，加入显色剂避光显色，最后加终止液终止反应，检测结果。

1.2.6 HE染色观察心肌损伤将心脏组织采用冰生理盐水冲洗，4%多聚甲醛溶液固定48 h，石蜡包埋，切片。按照HE染色试剂盒染色，并在400倍显微镜下观察心肌损伤情况。

1.2.7 流式检测细胞凋亡细胞经0.25%胰酶处理后收集于试管中，之后将其离心，采用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤1次。根据Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的说明书，通过FACS分析对FITC和PI荧光进行定量。细胞凋亡率(%)=早期细胞凋亡率+晚期细胞凋亡率。

1.2.8 蛋白印迹法检测Nrf2、NQO-1、HO-1蛋白的表达使用RIPA细胞裂解液从心脏组织中提取蛋白，并采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜后封闭1 h，加入兔来源的单克隆一抗(Nrf2为1∶1 000，NQO-1为1∶500，HO-1为1∶1 000，β-actin为1∶1 000)中，4 ℃ 孵育12 h；转移至山羊抗兔单克隆二抗液(1∶2 000)中，室温下孵育1 h，加显影液，于成像系统中曝光，使用软件Image Pro Plus 6.0分析蛋白条带灰度，蛋白表达水平以目标蛋白积分吸光度与内参蛋白β-actin积分吸光度值比值表示。

2 结果

2.1 咪达唑仑对2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心脏功能的影响与sham组比较，I/R组和DS组大鼠心脏LVSP、HR、CF降低(P<0.05或P<0.01)，LVEDP及血清LDH和CK-MB活性、cTnI含量升高(P<0.05或P<0.01)；与DS组和I/R组比较，DI/R组心脏LVSP、HR、CF降低(P<0.01)，LVEDP及血清LDH和CK-MB活性、cTnI含量升高(P<0.01)；与I/R组比较，I/RM组大鼠心脏LVSP、HR、CF升高(P<0.01)，LVEDP及血清LDH和CK-MB活性、cTnI含量降低(P<0.01)；与DI/R组比较，DI/RM组、I/RM组心脏LVSP、HR、CF升高(P<0.01)，LVEDP 及血清LDH和CK-MB活性、cTnI含量降低(P<0.01)。详见图1。