基于网络药理学探讨心脾同治方治疗慢性心力衰竭的作用机制

史胜楠，王培利，刘建勋

慢性心力衰竭是由于心脏结构或功能变化，导致心室泵血或充盈功能低下的一组复杂临床综合征，主要表现为呼吸困难、乏力、液体潴留等[1]。2017年慢性心力衰竭全球患病人数超6 430万人[2]，死亡率居高不下，日渐成为棘手的公共卫生问题。目前，主要以阻断神经内分泌过度激活和心脏重塑的治疗为主，但存在治疗靶点单一、毒副作用多、病人依从性差等问题[3]。中医学认为慢性心力衰竭病位在心，然“五脏皆致心力衰竭，非独心也”，心脾乃母子相生关系，心之气血阴阳亏虚，脾失运化，气血津液运行不畅，导致瘀血、痰浊、水饮等瘀阻心脉而加重病程[4]。母病及子，故心之病，必涉及脾。因此，心脾同治、调补心脾气血阴阳平衡为治疗之重。

心脾同治方是研究团队基于经典名方当归补血汤研究基础，结合临床实践总结的经验方，由生黄芪、当归、白术、丹参、黄连、红景天组成，具有益气活血、养心健脾的功效。课题组前期体内、体外研究证实，黄芪、当归组方通过激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKt)，提高心肌梗死大鼠心肌细胞内血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达，从而发挥促血管新生作用[5]。益气药可抑制心肌细胞外基质过度沉积，减轻心室重构，改善心肌梗死后心功能[6]。为进一步探讨心脾同治方治疗慢性心力衰竭的作用机制，本研究基于网络药理学方法，利用多种相关网络数据库，从化合物-靶点-信号通路-疾病多维度进行深入分析。

1 资料与方法

1.1 心脾同治方相关信息的整理和收集 通过中药系统药理学技术平台(TCMSP)数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)获取心脾同治方六味中药的化学成分，将口服生物利用度(OB)和类药性(drug-likeness，DL)作为筛选阈值，设定OB≥30%，DL>0.18。同时汇集化学成分对应的有效靶点，并录入UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)进行校正、转化和删重，最终获取心脾同治方活性成分的基因靶点。

由于TCMSP数据库未收录红景天，因此在TCMID数据库(https://bigd.big.ac.cn/databasecommons/database/id/437)中检索红景天的化学成分，并将该成分返回TCMSP数据库，检索OB和DL值，对未检索到的成分，通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得该成分的二维结构或SMILE号，并进一步在Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测红景天成分靶点。

1.2 慢性心力衰竭相关靶点数据构建 基于人类基因数据库(GeneCards，https://www.genecards.org/)和美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=)遴选慢性心力衰竭的靶点，利用Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)对比分析药物、疾病的潜在靶点，筛选出交集靶点。

1.3 心脾同治方与慢性心力衰竭的网络构建及分析 将交集靶点输入STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)构建蛋白互作(PPI)图，并导入Cystoscape 3.6.0软件中，构建“化合物-靶标-疾病”网络图，通过Network Analyzer工具进行拓扑分析，探讨心脾同治方活性成分的“多靶标-多通路-多层次”的治疗作用。

1.4 生物信息学基因本体(GO)分析及信号通路富集分析 将药物疾病共有靶点进行GO分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析，引用Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，收集P<0.01，Min Overlap为3且MinEnrichment>1.5 的项目进行筛选，综合预测心脾同治方治疗慢性心力衰竭关键靶点的生物学特性及调控通路。

2 结 果

2.1 心脾同治方活性成分筛选 经过检索筛选并去重，获得化学成分白术4个、丹参58个、当归2个、红景天6个、黄连11个、黄芪20个(虽然黄芪皂苷类不符合ADME筛选标准，已有大量文献证实黄芪皂苷对治疗慢性心力衰竭有明显的疗效[7]，因此将该类成分纳入研究)，由于筛选的活性成分较多，故选取部分活性成分，详见表1。该方成分作用的所有靶点经去重后共499个，使用Cytoscape 3.6.0软件构建化合物-靶点网络图，详见图1。Network Analyzer工具进行拓扑分析，得知网络中有601个节点、2 099个边，节点度值大小表示重要程度，排名居前10位的化合物及其靶点详见图2。其中化合物包括檞皮素、3-辛醇、花色苷、桃金娘烯醇、黄芪皂苷Ⅳ、山柰酚、木樨草素、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ；对应靶点包括PTGS2、SCN5A、PTGS1、ADRB2、CHRM1、RXRA、ADRA1A、NICOA2、AR、ACHE。

图1 心脾同治方化合物-靶点网络图

图2 节点度值居前10位的化合物及靶点

表1 心脾同治方的主要活性成分

2.2 慢性心力衰竭相关靶点数据构建 以“chronic heart failure”为关键词，在GeneCards数据库和NCBI基因数据库中检索。由于GeneCards数据库检索到的基因数量庞大，将relevance值[8]通过中位数筛选3次，共获得1 234个相关基因。NCBI基因数据库得到761个基因，合并去重后得到1 560个慢性心力衰竭相关基因。将药物与疾病的靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1，得到254个交集靶点，作为心脾同治方作用于慢性心力衰竭的预测靶点进行通路富集分析。详见图3。

图3 中药复方与慢性心力衰竭靶点韦恩图

2.3 PPI网络构建及拓扑分析 将交集靶点输入STRING数据库，设置研究物种为“Homo sapiens”，最低相互作用评分设置为“highest confidence(0.900)”，隐藏网络中的单一节点，其余参数保持默认设置，进行PPI网络的构建，详见图4。图中共涉及254个节点、1 309条边，平均节点度值为10.3，聚类系数为0.491。将PPI网络导入Cystoscape 3.6.0软件中，构建心脾同治方化合物-靶点-疾病网络图，详见图5。Network Analyzer进行拓扑分析，以自由度(degree)、介数中心性(betweenness centrality)、平均最短路径长度(average shortest path length)、接近中心性(closeness)作为参考标准，通过degree排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点，共34个，主要包括信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶1(Akt1)、c-JUN氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JUN)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)等，将这些靶点作为心脾同治方治疗慢性心力衰竭的关键靶点。选取居前20个关键靶点，详见图6。

图4 中药-慢性心力衰竭共有靶点PPI网络图

图5 中药化合物-靶点-慢性心力衰竭网络图

图6 中药-疾病关键靶点(degree值，居前20位)

2.4 生物信息学GO分析 将共有靶点导入Metascape数据库进行GO富集分析，共富集到7 137条生物过程(biological process，BP)、1 072项分子功能(molecular function，MF)、605项细胞组成(cellular component，CC)。BP主要涉及血液循环、循环系统、MAPK级联调节、多肽应答、细胞对氮化合物的应答、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、脂多糖应答等方面。CC主要涉及膜筏、溶酶体、囊泡腔、受体复合物等，主要集中在细胞膜和蛋白复合物上。MF主要包括蛋白激酶活性、蛋白质结构域特异性结合、细胞因子受体、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白质二聚体活性等方面，根据每个项目P值及基因数绘制条形图，详见图7。

图7 GO富集分析柱状图

2.5 KEGG通路富集分析 将共有靶点导入Metascape数据库进行KEGG通路富集分析，总共富集到280条信号通路。相关通路涉及糖基化终末产物(AGE)及其受体(RAGE)信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、PI3K/Akt信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路、低氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、辅助性T细胞17(Th17)分化、TNF信号通路、细胞凋亡等。根据每条项目P值及基因数量绘制气泡图，详见图8。

图8 KEGG富集分析气泡图

3 讨 论

慢性心力衰竭的发病机制与交感神经系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、炎性因子过度激活有关，脾胃受自主神经的影响，二者均通过不同递质产生不同的病理变化，同时慢性心力衰竭常合并胃肠瘀血导致脾胃功能紊乱，可见心脾关系密切[9]。心脾同治方中黄芪补益心脾之气，助心气推动血液运行，助脾气化生气血之源，为君药；当归、丹参养血活血，红景天益气活血化瘀，《本草纲目》记载：“红景天，本经上品，祛邪恶气，补诸不足”，三药为臣；黄连入中焦，清热燥湿，祛肠胃之瘀滞，为佐药。白术苦温入脾经，燥湿健脾，加强益气助运之力，同时引诸药入脾经，为使药。

本研究运用网络药理学方法对心脾同治方成分、靶点与疾病的生物信息学进行综合分析。心脾同治方化合物靶点网络中，具有高度中心性的关键化合物分子主要来源于黄芪、红景天、丹参，这3味药物广泛用于心血管领域。其中槲皮素、3-辛醇、花色苷、山柰酚均具有较强的抗炎活性[10]。课题组研究发现，檞皮素、山柰酚可抑制核转录因子-κB和Akt磷酸化而减少心脏成纤维细胞TNF-α、IL-6及IL-1β炎性因子分泌[11-12]。檞皮素可降低冠心病病人IL-10、TNF-α表达[13]，通过多重信号通路抑制氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)介导的内皮损伤，发挥抗动脉粥样硬化的作用[14]。木樨草素通过抑制促凝蛋白酶活性、纤维蛋白原与凝血酶之间的相互作用，发挥抗血栓功能[15]。桃金娘烯醇可激活超氧化物歧化酶等内源性抗氧化酶活性，维持促凋亡和抗凋亡途径(Bax和Bcl-2)平衡，以此减少缺血再灌注后的心肌损伤[16]。黄芪皂苷Ⅳ具有保护心肌缺血、调节肌浆网Ca2+泵、促进血管生成、改善能量代谢、抑制心肌肥厚和纤维化、减少心肌细胞凋亡的作用[17]。化合物靶点自由度较高的前列环素内过氧化物合酶2(PTGS2)是花生四烯酸合成前列环素类(PGs)和血栓素A2(TXA2)的关键酶，参与动脉硬化的病理过程，其过度表达导致血管壁炎症反应，刺激血管平滑肌细胞增殖和迁移[18]。

SCN5A基因编码Na_v1.5的α亚基，该通道主要控制内向钠电流，并在调节心脏电生理功能方面发挥关键作用，SCN5A表达减少导致小鼠心肌中晚期Na+电流增加，活性氧不断累积，造成心肌细胞结构紊乱，线粒体损伤和纤维化[19]。MAPK1、MAPK3、MAPK14属于MAPK家族[20]，通过细胞外信号调节激酶(ERK)、p38蛋白激酶、JNK等多条通路调控细胞凋亡、能量代谢、神经内分泌因子释放，从而控制炎症反应，改善心力衰竭[21-22]。由此可见，心脾同治方在抑制炎症反应方面发挥着重要作用。

通过对交集靶点分析发现，STAT3自由度相对较高，即STAT3在心脾同治方治疗慢性心力衰竭过程中具有重要的生物学意义。作为诸多细胞内信号通路的关键蛋白，STAT3参与心肌细胞凋亡、心肌能量代谢、心室重构、炎症反应等病理生理改变[23-24]。关键靶点中的炎性因子TNF-α、IL-6与心力衰竭严重程度密切相关，可降低左室射血分数，直接损伤心肌纤维，导致心肌收缩功能减退[25]，同时促炎因子激活STAT3发挥作用。

KEGG富集通路主要包括流体剪切应力与动脉粥样硬化、PI3K/Akt通路、炎性因子相关信号通路、HIF-1信号通路、细胞凋亡等。FSS是血流与血管壁摩擦产生的平行于血管壁的切线应力[26]。有研究显示，低FSS诱导内皮功能紊乱，促使动脉粥样硬化的发生及斑块形成，同时升高一氧化氮合酶3活性和VEGFA表达[27]。细胞凋亡是由基因调控的细胞程序性死亡，有助于维持机体内环境稳定，过度的心肌细胞凋亡导致心肌收缩单位进行性丢失，造成心功能不全[28]。Th17细胞是以分泌IL-17为特征的辅助性淋巴细胞亚群，产生IL-17、IL-6、TNF-α，这些炎性因子激活导致炎症级联反应，反之诱导心肌细胞凋亡程序的启动，加重心力衰竭进程[29]。PI3K/Akt作为重要的信号转导途径，其激活作用于下游的TNF-α/核转录因子-κB、IL-6/STAT3、Bcl-2/p53等多个靶点，抑制炎症反应，清除氧自由基，调控线粒体能量生成，维持心肌细胞凋亡机制的动态平衡，进而维持正常心功能[30-31]。缺血性心脏病、心力衰竭的病理生理发展过程中，HIF-1作为转录调节因子，通过调节血管生成、血管重塑、维持葡萄糖代谢和氧化还原稳态，发挥重要的保护作用[32]。

综上所述，心脾同治方通过PI3K、Akt1、MAPK、STAT3、IL-6、TNF-α、VEGFA等关键靶点，调控PI3K/Akt通路、HIF-1信号等通路抑制炎症反应，改善心室重构，减少心肌细胞凋亡，提高心肌能量代谢，为心脾同治方治疗慢性心力衰竭的进一步研究提供了依据。