低度米酒发酵工艺优化及发酵动力学模型建立

李静雯，张东亚，陆 洋，许译文

（贵州省轻工业科学研究所，贵州贵阳 550007）

米酒是我国传统特色食品，具有较高的营养价值[1]。目前，国内外有关米酒的研究主要集中在发酵工艺条件优化[2]、成分分析[3]、原料分析[1，4]以及酒曲制作及研究[5]等方面，而有关低度米酒的制作工艺及发酵动力学的研究分析较少。

发酵动力学是生化反应工程的基础内容之一，以研究发酵过程的反应速率和环境因素对速率的影响为主要内容[6]。贵州省轻工业科学研究所联合多家单位制作的单工位多模态智能发酵罐，其设计是基于发酵过程的工艺控制。因此，通过发酵动力学的研究，可进一步了解各发酵参数之间的关系，为发酵过程的工艺控制、发酵罐的设计放大和利用计算机对发酵过程进行控制提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：糯米，五常市锦鸿米业有限公司；酒曲，昆明市呈贡吉兆酒曲厂。

试剂及耗材：超纯水，自产；平板计数琼脂，上海博微生物科技有限公司；氯化钠（分析纯），成都金山化学试剂有限公司。

仪器设备：Testo 205 便携式pH 计，德图仪表（深圳）有限公司；0-50 %手持折光仪，深圳鼎鑫宜；超纯水仪，Heal Force Easy15；RE-52A 旋转蒸发仪，上海亚荣；SPX-150 生化培养箱，上海豫明；JA2003 电子天平，上海浦春计量仪器有限公司；LS-75HD立式灭菌器，滨江医疗；SW-CJ-2FB超净工作台，上海豫明。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程及操作要点

本试验采用工艺流程：糯米→浸泡→蒸煮→加浆→拌曲→发酵→过滤→杀菌→成品

操作要点：

（1）浸泡：浸泡糯米水温在20～30 ℃之间，浸泡时间为7～12 h。

（2）加浆量：加浆量为米重的2.5倍。

（3）拌曲：拌曲温度应在35 ℃±2 ℃。

（4）发酵：发酵前2 d，每24 h 搅拌1 次，发酵48 h后进行密闭发酵。

（5）过滤：先使用50 目网筛过滤，再使用100 目的尼龙布进行过滤即得。

（6）杀菌：采用超声波（15 min）与脉冲强光协同紫外（10 min）联合杀菌。

1.2.2 单因素试验

将低度米酒的发酵基础条件设为酒曲添加量0.7%，发酵温度30 ℃，发酵时间为7 d，以感官评分作为评价指标，分别对酒曲添加量0.3 %、0.5 %、0.7%、0.9%；发酵温度25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃；发酵时间5 d、7 d、9 d、11 d 进行试验，观察不同条件对低度米酒感官评分的影响。

1.2.3 正交试验

为确定低度米酒的最佳发酵工艺，经单因素分析，选择影响米酒品质的因素，进行正交试验。

1.2.4 发酵过程参数测定

在最佳工艺条件下，每24 h 进行菌落总数、糖度、酒精度、pH值的测定，具体检测方法如下。

菌落总数测定：参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行测定。

酒精度测定：参考GB 5009.225—2016《食品国家安全标准酒中乙醇浓度的测定》进行测定。

pH值测定：采用便携式pH计进行测定。

TSS测定：采用折光仪测定，并以°Bx表示。

1.2.5 感官品评方法

感官品评方法首先用0～4 评判法[7]确定各指标的权重，再利用模糊数学感官评价法[8]对发酵型低度米酒进行品评，所有的评价指标分为4 个等级：优秀(90 分)、良好(80 分)、中等(70 分)、较差(60分)。感官要求参考T/GZSX 017—2020《贵州米酒》中发酵型米酒感官品评要求，详见表1。

表1 米酒(发酵型)感官要求

1.2.6 发酵动力学模型的建立

根据低度米酒发酵过程中菌落生长情况、酒精含量、pH 生成和TSS 消耗建立菌群生长、酒精生成、酸性物质生成和TSS消耗的动力学模型。

1.3 数据处理

运用Origin 2021 软件进行绘图，并对低度米酒发酵过程中菌落总数、酒精含量、酸性物质生成量、TSS 消耗量进行非线性拟合。通过回归求解动力学模型参数，建立菌落总数生长、酒精生成、酸性物质生成和TSS 消耗的动力学模型方程。利用Excle进行数据统计，SPSS 26.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 评价指标权重分析

将各指标之间进行两两比较，如果重要程度较大则记为1，否则为0，指标自身不进行比较[8]。指标权重评判共6 人(3 男，3 女)，评价结果如表2所示。

表2 评价指标权重分布

综上所述，将低度米酒评价指标权重计为N=(0.23,0.26,0.31,0.20)。感官品评时所有参评人员(8人)只给出每个指标的优秀、良好、中等、较差共4个等级的评判，最终进行计算统计。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 加曲量对感官品评的影响

由图1 可知，加曲量为0.3%时，由于用曲量少发酵不充分，TSS(5.5 %)、酒精度(6.1 %vol)较其他组低，感官上风味及滋味偏向甜酒酿。

图1 加曲量对感官品评的影响

随着酒曲添加量的增加，在0.7 %时发酵的米酒，米香较好，且口感好，因此适宜的酒曲添加量为0.7%。对加曲量进行显著性分析，结果表明，加曲量在0.3 %～0.7 %之间感官评分结果差异显著（p＜0.05），其他加曲量之间差异不显著（p＞0.05），通过该试验确定以加曲量0.6%、0.7%、0.8%作为正交试验的3个水平。

2.2.2 发酵温度对感官品评的影响

由图2 可知，当发酵温度在40 ℃时，由于温度过高，导致米酒苦味重，且酸度较大(pH 3.46)，因此感官评分较低(73.49 分)。而发酵温度低于30 ℃时，微生物生长较为缓慢，外观较黏稠，因此感官评分较低(76.98分)。

图2 发酵温度对感官评分的影响

经显著性分析，40 ℃下的感官评分与30 ℃、35 ℃的感官评分差异显著（p＜0.05）。发酵温度在25 ℃、30 ℃、35 ℃时，感官评分差异不显著(p＞0.05)，综上所述，试验确定以28 ℃、30 ℃、32 ℃作为正交试验发酵温度的3个水平。

2.2.3 发酵时间对感官评分的影响

由图3 可知，在一定温度和酒曲添加量下，随着发酵时间的延长，感官评分呈现先增加后降低的趋势。

图3 发酵时间对感官评分的影响

经数据分析，发酵时间之间差异不显著(p＞0.05)，发酵7 d 和发酵11 d 之间差异显著（p＜0.05）。当发酵时间为5 d 时，由于发酵时间较短，产生的酒度低，米香淡，发酵时间延长至11 d 时，其酸度增加，苦味较突出[9]，发酵时间过长或过短所得成品感官均较差。因此，选择发酵时间6 d、7 d、8 d作为正交试验发酵时间的3个水平。

2.3 正交试验结果与分析

为确定低度米酒的最佳配方，在单因素试验的基础上，选取影响低度米酒品质的3 个主要因素，即加曲量(A)、发酵温度(B)和发酵时间(C)，采用L9(33)正交实验法，对各因素水平的设置见表3。

表3 各因素水平对照表

根据上表进行正交试验，正交试验结果及极差分析见表4。

表4 正交试验结果及极差分析

正交实验方差分析结果见表5。

表5 正交试验方差分析结果

由表4 和表5 可知，对低度米酒发酵影响顺序为发酵时间(C)＞发酵温度(B)＞加曲量(A)，最优水平为C2B1A2，即发酵时间7 d，发酵温度28 ℃，加曲量0.7 %，此时感官评分最高为82.08 分，此时TSS 13.5°Bx，pH3.98，酒精度11.4%vol。

2.4 重复试验结果

将感官评分差异不显著的A2B1C2与A2B3C1进行重复试验，试验结果见表6。

表6 重复试验结果

由表6 可知，A2B1C2感官评分略高于A2B3C1，因此最终确定最佳发酵工艺为发酵时间7 d，发酵温度28 ℃，加曲量0.7%。

2.5 低度米酒主要指标变化情况

2.5.1 发酵过程主要指标的检测

基于最优工艺条件，对发酵过程主要指标(菌落总数、酒精度、pH 值、TSS)进行测定，变化曲线见图4。

图4 低度米酒发酵过程主要指标变化图

由图4 可知，从第5 天开始，TSS 含量减少趋势缓慢，并逐渐趋于稳定，这可能是由于酵母菌也在这一时期开始逐渐衰亡，底物消耗逐渐减弱，这也预示着发酵基本完成。发酵过程中酒精度含量在发酵前2 d 变化很小，一方面是由于酵母菌处于生长适应阶段，还未完全进行产酒精作用；另一方面是由于前2 d 进行有氧发酵，此时糖化酶作用于发酵醪中的淀粉、糊精将其水解生成糖类、有机酸类物质，因此糖度较高，酒精度低，pH 值下降快，有氧微生物繁殖速度较快。

从发酵第3 天开始，进入无氧发酵阶段，该阶段糖度下降快，酒精度快速上升，又有发酵醪中的蛋白质在蛋白酶的作用下，水解生成小分子的蛋白质、肽和各种氨基酸的反应，这些水解产物，一部分被酵母细胞吸收合成菌体，另一部分则发酵生成了酒精和二氧化碳，还产生副产物杂醇油、甘油等，该过程pH 值下降程度变缓，酵母菌开始大量繁殖，将糖转化为酒精，导致酒精度大幅度上升，在发酵第7 天酒精度达到最大值，为11.6 %vol。从酒精度、TSS 含量、菌落总数以及pH 值随发酵的变化上看，四者之间相互联系，变化符合发酵规律。

2.5.2 菌落总数生长模型建立

菌群的生长动力学模型大多使用Monod 和Logistic 方程。Monod 方程表述简单、应用范围广泛，但仅适用于细胞生长较慢和细胞密度较低的环境下[10]；而Logistic 方程描述菌体生长情况，可以反映出发酵过程中因菌体的增加而抑制自身生长的作用，对拟合菌体生长过程具有一定的适用性[11]，因此通过Logistic方程进行拟合。

式中：Y 表示发酵过程中菌落总数，×106cfu/mL；A1表示初始菌落总数，×106cfu/mL；A2表示最终菌落总数，×106cfu/mL；x表示发酵时间，d；x0、p 为方程系数。

通过origin2021 软件对菌体数量和方程式(1)进行拟合，得到A1=2.63538，A2=7.06471，x0=2.81754，p=6.182，带入式(1)得菌落总数随发酵过程变化的动力学模型式(2)。

菌落总数生长试验值与预测值模型拟合曲线如图5所示。

图5 菌落总数拟合曲线

在低度米酒的发酵过程中，菌群的生长代谢决定了产物的生成以及基质的消耗。由于糯米中富含支链淀粉[14]，因此前两天有氧发酵阶段，菌群主要产生糖化酶将淀粉转化为糖元，这与TSS 消耗情况相对应。由图5 可知，发酵过程中菌落总数的变化曲线的拟合度较好，Logistic 模型R2=0.98669，表明该模型能较好的反映菌落总数的生长情况。

2.5.3 酒精生成发酵动力学模型建立

酒精的生成是微生物主要能量代谢的直接结果，产物的生成和细胞的生长是同步的和完全偶联的[12]。因此，利用与菌落总数相同的方程进行拟合。

式中：Y 表示发酵过程中酒精度，%vol；A1表示初始酒精度，%vol；A2表示最终酒精度，%vol；x 表示发酵时间，d；x0、p 为方程系数。

通过origin 2021 软件对酒精度和方程式（3）进行拟合，得到A1=0.85547，A2=11.6873，x0=3.56228，p=7.78307，带入式（3）得酒精度随发酵过程变化的动力学模型式（4）。

酒精生成试验值与预测值模型拟合曲线如图6所示。

图6 酒精度拟合曲线

由图6 可知，由于酒曲中含有多种菌群，因此前2 d 有氧发酵阶段依然有酒精生成，进入无氧发酵阶段酒精生成速率加快，当菌群进入到稳定期和衰亡期，产酒精作用逐步减缓，曲线平缓下降[15]。发酵过程中酒精度的变化曲线的拟合度较好，Logistic模型R2=0.98922，表明该模型能较好的模拟酒精的生成。

2.5.4 酸类物质生成动力学模型建立

酸类物质的生成既与菌体生长速率有关，也与菌体浓度有关。发酵过程中由于微生物对培养基中碳源、氮源等的利用，随着有机酸或氨基氮的积累，会使酸度产生一定的变化[6]。因此，采用Boltzmann模型建立该方程。

式中：Y 表示发酵过程中pH 值；A1表示初始pH 值；A2表示最终pH值；x表示发酵时间，x0、dx为方程系数。

通过origin 2021 软件对pH 值和方程式（5）进行拟合，得到A1=4.50978，A2=3.97569，x0=3.01584，dx=0.92478，带入式（5）得pH 值随发酵过程变化的动力学模型式（6）。

酸类物质生成试验值与预测值模型拟合曲线如图7所示。

图7 酸类物质生成发酵动力学模型

酸类物质的生成与微生物生长部分偶联，产物是能量代谢的间接结果[12]。在微生物的作用下，有氧发酵过程中根霉及乳酸菌分解产生乳酸等有机酸，使得pH 值快速下降；无氧发酵过程中酵母菌的酒精发酵作用将有机酸降解为酒精等小分子物质，因此pH值逐渐下降速率变缓[13]。由图7可知，发酵过程中酸类物质生成的变化曲线的拟合度较好，Boltzmann 模型R2=0.99194，表明该模型能较好的模拟酸类物质的生成。

2.5.5 基质消耗动力学模型建立

在低度米酒的发酵过程中，TSS 的消耗模型属于底物消耗，基质底物是菌种生长代谢的物质基础，又涉及产物的合成。在微生物发酵过程中，主要消耗在三个方面：一是用于合成新的细胞物质，二是用于合成代谢产物，三是提供细胞生命活动的能量[6，12]。通过物料平衡，利用Boltzmann模型建立方程如下。

式中：Y 表示发酵过程中TSS 的值，°Bx；A1表示初始TSS 的值，°Bx；A2表示最终TSS 的值，°Bx；x 表示发酵时间，x0、dx为方程系数。

通过origin 2021 软件对TSS 和方程式（7）进行拟合，得到A1=28.66602，A2=13.55812，x0=2.5768，dx=0.7125，带入式（7）得TSS 随发酵过程变化的动力学模型式（8）。

图8 基质消耗反应动力学模型

TSS 中大部分为可溶性糖[16]，糖作为微生物生长代谢必须的碳源，其生成与糯米淀粉水解有关[17]，主要是由于在前48 h 有氧发酵阶段，酒曲中的根霉、毛霉等大量生长繁殖，产生糖化酶，将糯米中的支链淀粉转化为糖元，为后续酵母、细菌等利用其产生酒精提供充足的基质。在拟合方程中，选择了拟合度较高的Boltzmann 方程进行拟合，其R2=0.99631，表明该模型能较好的模拟基质的消耗。

3 结论与讨论

通过对低度米酒工艺的探究，确定了最佳发酵工艺为加曲量0.7%，发酵温度28 ℃，发酵时间7 d，进行重复试验后监测其发酵过程菌落总数、酒精度、pH值和TSS的变化，并进行了模型建立，且4个监测值的模型拟合程度较好，分别为0.98669、0.98922、0.99194 和0.99631。但是由于监测设备受限，未进行含氧量（DO）的监测，且由于酒曲中菌群复杂，无法利用比浊度进行菌液含量的测定，因此试验仅是对低度米酒发酵过程进行了粗略的检测，可作为发酵罐设计所需的基础发酵工艺参考数据。