响应面法优化低酒精度桑果酒发酵的工艺参数

卢军，刘开莉，陆春霞，肖潇，周晓玲，梁贵秋，唐永飞，彭业成，韦炳佩

（广西壮族自治区蚕业技术推广站，南宁市 530007）

桑果是药食同源的食物［1］，含有丰富的营养及活性物质［2］。梁贵秋等［3］研究表明，桑果含有丰富的糖类、有机酸、胶质、天然色素、维生素C、B1、B2等多种维生素、人体必需的氨基酸及铁、钙、锌、硒、锰等多种微量元素，具有补血、益肾、明目、乌发、抗衰老、降血压、预防慢性肝炎、治疗失眠和神经衰弱等多种医疗保健功能［3］。但是桑果含水率较高，约85%［4］，不耐贮存，容易腐烂，是季节性较强的水果，在广西地区每年3—4月集中上市，货架期较短。为了克服鲜桑果难以保存的不足，科研人员把桑果深加工后制成桑果酒［5］、桑果脯［6］、桑果醋［7］、桑果饮料［8］等，而桑果酒因含有大量的营养及活性物质［9］，深受人们的青睐。低酒精度桑果发酵酒通常指酒精度较低，即酒精度≤3% vol 的桑果发酵酒。低酒精度桑果发酵酒是顺应市场需要而研制的桑果深加工新产品，因其酒精含量低、口感好而深受人们的欢迎，市场前景广阔。本研究重点在于确定低酒精度桑果发酵酒的发酵工艺参数，为低酒精度桑果发酵酒的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 菌种来源 菌种为果酒酵母，生产厂家为安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 主要试验试剂 低聚果糖（FOS 含量55%）为南宁纵联科技有限公司生产；Na2HPO4为分析纯，100%乙腈为色谱纯，均由广东汕头市西陇化工厂生产；无水葡萄糖为分析纯，购于天津市大茂化学仪器供应站；超纯水为自制。

1.1.3 试验仪器 AL-2004 电子分析天平，由梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司生产；722 分光光度计，由上海第三分析仪器厂生产；R500L发酵罐，由江苏天宇公司生产；PHS-25 精密数显酸度计，由上海电子仪器厂生产；HH-4 电子恒温水浴锅，由常州澳华仪器有限公司生产；ANKE-TGL-16G台式离心机，由上海安亭科学仪器厂制造；LC-10A 高效液相色谱仪，由日本岛津公司生产；DZF-6050培养箱，由常州恒隆仪器有限公司生产。

1.2 培养基制备和培养方法

1.2.1 斜面保存培养基 斜面保存培养基配方为2.50%葡萄糖、1.50%蛋白胨、1.00%酵母浸出粉、0.02%NaH2PO4、2.00%琼脂，pH 为6.8～7.2。将配好的培养基于121 ℃、0.1 Mpa条件下灭菌30 min，接种后置于28 ℃条件下培养30 h。

1.2.2 分离培养基 分离培养基配方为3.00%低聚果糖、1.50%蛋白胨、1.00%酵母浸出粉、0.20%硝酸钠、0.02%NaH2PO4、2.00%琼脂。将配好的培养基于121 ℃、0.1 Mpa条件下灭菌30 min，接种后在真空负压培养箱中于30 ℃条件下培养48 h。

1.2.3 一级酵母发酵种培养基 一级酵母发酵种培养基配方为3.50%低聚果糖、1.00%玉米浆粉、2.50%豆饼粉、0.15% MgSO4·7H2O、0.05%KH2PO3、pH为6.8～7.0，将配好的培养基于121 ℃、0.1 Mpa条件下灭菌60 min。接种后置于温度30 ℃条件下培养20～28 h。

1.2.4 100 L 二级酵母发酵种培养基 二级酵母发酵种培养基配方为3.50%低聚果糖、1.00%玉米浆粉、2.50%豆饼粉、0.05%NaH2PO3、pH 为6.5～7.5。培养基配好后于121 ℃、0.1 Mpa条件下，灭菌60 min。接种后于温度为30 ℃的条件下发酵20 h。

1.2.5 500 L 三级酵母发酵种培养基 三级酵母发酵种培养基配方为5.00%低聚果糖、1.00%玉米浆粉、1.50%豆饼粉，培养基配好后于121 ℃、0.1 Mpa条件下灭菌60 min。接种后于pH 6.8～7.2、温度为30～28 ℃条件下发酵30～36 h。

1.2.6 酵母发酵和分离 用离心半径为40 cm，转速为2 950 r/min的沉降离心机离心30 min，分离得到黏稠酵母发酵种，置于1～3 ℃冰箱保存备用。

1.3 酒精度及残糖含量测定

参照国标GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法［10］。

1.4 低酒精度桑果发酵酒的加工工艺流程

桑果汁→接种酵母发酵→后发酵→澄清→调整→陈酿→过滤→灭菌→灌装→包装。

1.5 单因素试验设计方法

1.5.1 酵母接种量对发酵酒精度和残糖含量的影响 设置酵母接种量分别为3.0%、3.5%、4.0%，4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%，发酵温度为25 ℃，pH=5.5，桑果汁糖度为10%，发酵时间为72 h进行试验。

1.5.2 发酵温度对发酵酒精度和残糖含量的影响 设发酵温度分别为18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃，pH=5.5，桑果汁糖度为10%，发酵时间为72 h，酵母接种量为5.0%进行试验。

1.5.3 pH 对发酵酒精度和残糖含量的影响 设发酵pH 分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，温度为25 ℃，桑果汁糖度为10%，发酵时间为72 h，酵母接种量为5%进行试验。

1.5.4 桑果汁糖度对发酵酒精度和残糖含量的影响 用纯净水和低聚果糖调配桑果汁糖度分别为6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%，发酵温度为25 ℃，pH=5.5，酵母接种量为5.0%，发酵时间为72 h进行试验。

1.5.5 发酵时间对酒精度和残糖含量的影响 设发酵时间为48 h、52 h、58 h、64 h、70 h、76 h、84 h、90 h、96 h、温度为25 ℃，pH=5.5，桑果汁糖度为10%，酵母接种量为5.0%进行试验。

1.6 响应面试验方法

利用Design-Expert 7.0 软件中Box-Behnken 设计与分析，根据单因素试验结果分别以酵母接种量（A）、发酵温度（B）、pH（C）、桑果汁糖度（D）、发酵时间（E）为自变量，以酒精度（R1）和残糖含量（R2）为响应值，利用Box-Behnken 模型设计试验组作响应面分析，试验设计如表1所示。

表1 试验因素及水平值

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 酵母接种量对发酵酒精度和残糖含量的影响 在酵母接种量、发酵温度、时间等其它因素相同的情况进行单因素试验，结果见图1。由图1 可以看出，发酵酒精度随酵母接种量增加而增加，但增加比较缓慢，酵母接种量为3.0%时发酵酒精度为1.20%vol（以下不特别标明均为体积比），酵母接种量为5.5%时，发酵酒精度为1.52% vol，之后随酵母接种量增加，发酵酒精度增速有加快趋势，酵母接种量为6.0%时发酵酒精度为1.78%vol，酵母接种量为7.5%时发酵酒精度为2.43%。酵母接种量为3.0%时残糖含量为8.00%，随酵母接种量增加，残糖含量则随之减少，酵母接种量为7.5%时，残糖含量仅为0.50%，接近糖分完全被消耗。从图1可以看出，曲线的相交点约在酵母接种量为4.5%处，此时发酵酒精度为1.39%vol，残糖含量为4.40%。对比低酒精度桑果发酵酒的质量标准，发酵酒精度是合适的，但残糖含量过高。从发酵酒精度和残糖含量指标综合考虑，酵母接种量应选择在4.0%～6.0%的范围之内。

图1 酵母接种量对发酵酒精度和残糖含量的影响

2.1.2 温度对发酵酒精度和残糖含量的影响 温度对发酵酒精度和残糖含量的影响见图2。由图2可以看出，发酵酒精度随温度升高也平稳升高，当温度为18～26 ℃时随着发酵温度升高酒精度升高平稳，温度为18 ℃时酒精度为1.20% vol，温度为26 ℃时酒精度为1.46%vol，温度升高了8 ℃，酒精度升高了0.26% vol，即温度每升高1 ℃，酒精度平均升高0.03%vol；温度为26 ℃时发酵酒精度为1.46%vol，当温度为36 ℃时酒精度为2.17% vol，温度升高了10 ℃，而酒精度升高了0.71%vol，即温度每升高1 ℃酒精度平均升高0.07%vol。可见发酵温度低不利于酵母发酵产酒。温度为18 ℃时残糖含量为7.80%，随温度升高，残糖含量减少，当温度升高至36 ℃时，残糖含量为0.70%。发酵酒精度和残糖含量两曲线交汇点为酒精度1.28%，残糖含量为4.10%。交汇点残糖含量仍过高，不合适选为发酵工艺参数，而从图2可以得出合适的发酵温度为24～28 ℃。

图2 温度变化对发酵酒精度和残糖含量影响

2.1.3 pH对发酵酒精度和残糖含量的影响 pH变化对发酵酒精度和残糖含量的影响主要是发酵体系酸碱性对酵母活性作用的影响，具体结果见图3。由图3可以看出，pH=4.0时，发酵残糖含量为4.70%，当pH 升至6.0 时，发酵残糖含量降至1.00%左右，之后随pH 继续上升，残糖含量又开始上升，曲线呈“U”型，pH=7.0时残糖含量升至5.90%；pH=4.0时发酵酒精度为1.31%vol，随着pH 升高，发酵酒精度缓慢升高直至pH=5.5，然后从pH=5.5至pH=6.5时有一个明显上坡度，从pH=6.5 至pH=7.5 时又有一个下坡度。从残糖含量曲线和酒精度曲线可以分析出pH=4.0～5.5 和pH=6.5～7.5 是抑制酵母活性的pH 值范围，pH=5.5～6.5 是适合酵母生长的pH 值范围。结合残糖含量和酒精度两项指标综合考虑可以得出：pH=6.5 时残糖含最低，发酵酒精度最高，故发酵pH 范围选择应为pH=5.0～6.0。

图3 pH变化对发酵酒精度和残糖含量的影响

2.1.4 桑果汁糖度对发酵酒精度和残糖含量的影响 发酵过程中桑果汁中的糖是酵母利用的底物，发酵时桑果汁中含糖量高会得到更高的酒精度，但同时残糖含量也会增加，选择适合的桑果汁糖度是获得低酒精度桑果发酵酒的重要因素之一，桑果汁糖度对发酵酒精度和残糖含量的影响具体见图4。从图4中可以看出，残糖含量和酒精度都随糖度增加而增加，但开始增加较为缓慢，糖度为6°Bx时残糖含量和酒精度分别为1.10%和1.49%，糖度增加至10°Bx时残糖含量和酒精度分别为2.17%和1.97%，曲线坡度平缓，当糖度大于11°Bx时，曲线坡度增加较快，糖度为14 °Bx 时，残糖含量和酒精度分别为4.30%和4.80%。糖度增加即发酵底物浓度增加，结果是发酵酒精度增加；而残糖含量增加却是因为糖度增加了但发酵不完全造成的。通常桑果汁的糖度为8°Bx～10°Bx，发酵糖度应该选择自然糖度8°Bx～10°Bx。

图4 桑果汁糖度对发酵酒精度和残糖含量的影响

2.1.5 发酵时间对发酵酒精度和残糖含量的影响 发酵时间对发酵酒精度和残糖含量的影响见图5。由图5 可知，发酵48 h 时残糖含量和酒精度分别为29.00%和0.54%，此时发酵还没有完全，随发酵时间增加，残糖含量快速下降，酒精度缓慢升高。当发酵时间为72 h 时，残糖含量为5.60%，发酵时间为84 h时，残糖含量为3.10%，残糖含量下降速度明显减慢。发酵酒精度随发酵时间增加，一直平稳增加，增加的幅度不大。发酵时间对发酵酒精度和残糖含量的影响主要是随时间增加，酵母的生长受到影响。酵母生长期、对数期、衰老期、自溶期等［11］随时间增长依次出现酵母生理前期生长旺盛，消耗底物较多，残糖含量下降较快，后期生理期生命衰老，消耗底物较弱，残糖含量下降缓慢。综合残糖含量和酒精度两项指标，发酵时间应选择在72～84 h。

图5 发酵时间对发酵酒精度和残糖含量的影响

2.2 响应面优化分析

2.2.1 响应面试验结果 利用Design-Expert.7.0中软件Box-Behnken设计与分析，利用Box-Behnken模型设计试验组作响应面分析，试验设计与结果见表2。

表2 Box--Behnken试验设计与结果

续表2

2.2.2 酒精度的方差分析和回归模型 酒精度（R1）方差分析见表3。表3是采用响应面逐步回归模型修正法进行方差分析，不显著项已经修正删除。模型P值＜0.01，为极显著，说明各因素变量与R1之间的线性关系显著。失拟合项不显著（P=0.118 8＞0.05），说明本试验所得二次回归方程能很好地对R1进行预测。试验值与回归方程预测值的相关系数R12为0.980 1，说明该模型能解释98.01%响应值的变化，拟合情况很好。校正拟合度AdjR12为0.976 5和预测拟合度PredR12为0.967 5，两者数字相近，且值接近于1，说明该模型具有较好的回归性。离散系数表示试验的精确度，其值越小，试验结果的可靠性越高。本试验离散系数为2.93，在可接受范围内，说明试验结果可靠性很高。从回归方程系数显著性可知，一次项A、B和二次B2极显著，一次项C、E项，互交项AB、AC表现显著。由F值大小可得出各因数影响大小，依次为发酵温度（B）＞酵母接种量（A）＞发酵时间（E）＞pH（C）。经逐步回归拟合后得到二次多项式编码回归方程：

表3 R1响应逐步回归（stepwise）模型方差分析

酒精度R1/%vol=1.45+0.13×A+0.40×B+0.03×C+0.03×E+0.05×A×B+0.06×A×C+0.29×B2

2.2.3 酒精度（R1）的响应面分析 图6～图7 是AB、AC互交项为显著项所得到的二次回归方程的R1响应面的3D 图。图底部等高线及曲面形状反映交互作用大小，当为椭圆形时，表示交互作用显著，而圆形则表示交互作用不显著。

图6 AB互交响应值3D图

图7 AC 互交项响应值3D图

2.2.4 残糖含量（R2）的方差分析和回归模型R2方差分析见表4。表4 中R2采用响应面逐步模型修正法进行方差分析。模型P值＜0.01为极显著，说明各因素变量与转化率之间的线性关系显著。失拟合项P=0.694 0＞0.05，不显著，说明本试验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测。试验值与回归方程预测值的相关系数R22为0.932 8，说明该模型能解释93.28%响应值的变化，拟合情况很好。校正拟合度AdjR22为0.908 4和预测拟合度PredR22为0.842 8，两者数字相近，且值接近1，说明该模型具有较好的回归性。离散系数表示试验的精确度，其值越小，试验结果的可靠性越高。本试验离散系数为3.63，在可接受范围内，说明试验结果可靠性很高。从回归方程系数显著性可知，一次项A、B、D及二次项B2为极显著，互交项AB、BD、DE表现为显著。由F值大小可得出各因素影响大小，依次为发酵温度（B）＞酵母接种量（A）＞桑果汁糖度（D）＞发酵时间（E）＞pH（C）。经回归拟合后得到二次多项式编码回归方程：

表4 R2响应面逐步回归（stepwise）方差分析表

残糖含量R2/%=2.78－0.21×A－0.24×B+0.14×D－0.03×E－0.15×A×B+0.14×B×D－0.16×D×E－0.16×B2

2.2.5 残糖含量（R2）的响应面分析 图8～图10是AB、BD、DE互交项为显著项所得到的二次回归方程的R22响应值3D 图。图底部等高线及曲面形状反映交互作用大小，当为椭圆形时，表示交互作用显著，而圆形则表示交互作用不显著。

图8 AB互交项响应值3D图

图9 BD互交项响应值3D图

图10 DE互交项响应值3D图

2.2.6 响应面优化最佳控制参数 经过软件分析，设置软件响应值R1和R2为最小化，预测得到最佳控制参数：酵母接种量为6.0%，发酵温度为24.97 ℃，pH为5.0，桑果汁糖度为9.56%，发酵时间为72 h。响应面法优化结果见图11三维效果图。

图11 最佳条件三维效果和等高线图

图11是在pH（C）=5.0，桑果汁糖度（D）为9.56%，发酵时间（E）为72 h固定的情况下，以酵母接种量和发酵温度为自变更量的3D 效果图。由图11 可看出等高线互交作用显著，响应曲面的倾斜度较高，颜色也由浅蓝色向深绿色转变，说明交互作用显著，即模型可信度高。

2.3 模型验证

根据优化得到操作参数：酵母接种量为6.0%，发酵温度为24.9 ℃，pH=5.0，桑果汁糖度为9.56%，发酵时间为72 h。按实际操作修正为酵母接种量（A）为6.0%，发酵温度（B）为24.9 ℃，pH（C）=5.0，桑果汁糖度（D）为9.60%，发酵时间（E）为72 h。经过5 次重复试验，得到酒精度R1平均值为1.32%vol，残糖含量R2平均值2.29%，与软件预测数值基本一致。

3 小结

以桑果汁为原料发酵低酒精度桑果酒，桑果汁糖度、酵母量接种量、发酵温度、pH值、发酵时间都对发酵后酒精度、残糖含量有一定的影响，其中影响发酵后酒精度的因素顺序为：发酵温度＞酵母接种量＞发酵时间＞pH＞桑果汁糖度；影响发酵残糖含量的因素顺序为：发酵温度＞酵母接种量＞桑果汁糖度＞发酵时间＞pH。利用Design-Expert.7.0中软件Box-Behnken进行设计，利用Box-Behnken模型作响应面分析，并经过软件优化最终得到低酒精度桑果发酵酒发酵工艺参数：酵母接种量为6.0%，发酵温度为24.9 ℃，pH=5.0，桑果汁糖度为9.60%，发酵时间为72 h。

4 讨论

低酒精度桑果发酵酒与一般桑果发酵酒加工方法的不同之处在于发酵所用的酵母为混合酵母，该混合酵母由两种酵母构成，其中一种有利于桑果汁中的糖转化为酒精，另外一种有利于桑果汁中乙酸的降解，因此利用本研究工艺加工的桑果酒酒精度不高，乙酸含量低，在口感上、适合饮用的人群方面都优于一般的桑果酒，市场前景更为广阔。

低酒精桑果发酵酒所用的酵母来源于市场销售，本研究缺乏对酒精发酵产酒酵母和降酸酵母的生理特性和作用机理的深入研究，这有待进一步加强。

本研究的桑果发酵酒产品酒精度较低（＜10%vol），长期常温保存会影响其品质和口感，关于低酒精度桑果酒保质期的问题有待于进一步研究。由于市售桑果发酵酒的酒精度普遍高于10%vol，通常为12%vol～14%vol，因此对保存期无需特别说明，而利用本研究工艺发酵的低酒精度桑果发酵酒的酒精度较低，因此在实际生产中需要注意保质期问题。