配制酒多糖提取条件优化

滕 娟，滕晓燕，史文秀，陈 楠

（江苏双沟酒业股份有限公司，江苏宿迁 223800)

配制酒，又称调制酒，是酒类里面一个特殊的品种，不专属于哪个酒的类别，是混合的酒品。近年来随着人们生活水平的提高，在大健康产业的带动以及健康消费理念的推动下,保健型配制酒得到较快发展，由于保健型配制酒中含有有益于人体健康的多糖、皂苷、黄酮类等营养物质而比普通白酒更具有养生功效，越来越被消费者所喜爱。其含有的多糖(polysaccharide)是由糖苷键结合的糖链，至少由超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C6H10O5)n表示。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。研究证明，多糖能够促进免疫系统功能，让免疫系统能够不断生产自然杀手细胞、干扰素、白细胞介素来摧毁已经存在的癌细胞，进而维护整个免疫系统的健康平衡。但是关于配制酒中多糖的检测方法还没有出台针对性的国家标准。没有统一标准，各企业均根据实际情况来制定自己的企业标准，检验方法都还在不断摸索与完善中。

本实验主要运用乙醇沉淀法来进行配制酒中多糖的提取，通过对提取过程的分析，可以发现多糖提取主要涉及乙醇提取浓度、冷藏温度和水提温度3个实验条件。通过单因素试验和正交试验找出最佳乙醇提取浓度、最佳冷藏温度、最佳水提温度，从而对配制酒多糖检测的前处理过程中设计的实验条件进行明确与完善，提高配制酒检测中多糖的提取效率，提高检测准确性。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：市售白酒及保健型配制酒产品。

试剂及耗材：多糖标准品、无水乙醇、硫酸、苯酚、无水葡萄糖等。

仪器设备：紫外分光光度计、离心机、控温医用冷藏箱、电炉、温度计、移液管等。

1.2 试验方法

1.2.1 理论依据

1.2.1.1 关键实验条件分析

（1）乙醇提取浓度：多糖类物质由于其分子中含有大量的极性基团，与水有较大的亲和力，易溶于水而不溶于乙醇等醇类物质。

（2）冷藏温度：低温环境条件下可使多糖从高浓度的乙醇溶液中析出。

（3）水提温度：多糖极易溶于热水。

1.2.1.2 试验原理

（1）采用乙醇沉淀法提取多糖，多糖类物质由于其分子中含有大量的极性基团，与水有较大的亲和力，易溶于水而不溶于乙醇等醇类物质。且多糖极易溶于热水。随着乙醇浓度的升高能够沉淀出的多糖分子量越来越小，当乙醇浓度达到85%时可以沉淀出单糖。

（2）采用硫酸-苯酚法对提取的多糖进行定量，多糖在硫酸作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物。用紫外分光光度法测定多糖含量。

1.2.2 试验步骤

试验设计思路：分别将乙醇提取浓度、冷藏温度和水提温度其中的一个实验条件作为变量，保持其他实验条件、试剂及仪器设备不变的情况下进行单因素试验。再将影响醇沉步骤的两个单因素变量进行正交试验，分别找出每个试验条件中的最佳变量，最后对研究结果进行综合对比验证。

操作步骤：取供试品1.0 mL，置离心式管中，加入无水乙醇至乙醇浓度80%，摇匀，冷藏1 h，取出，离心（转速为4000 r/min）20 min，弃去上清液，加热水1 mL 溶解即得。精确量取上述所得溶液1 mL，加入5 %苯酚溶液（临用配制），摇匀，再加入硫酸5 mL，摇匀，至沸水浴中加热20 min，取出，至冰浴中冷却5 min，以相应试剂为空白，利用紫外分光光度计法在波长488 nm 处测定吸光度[1]（注：吸光度与多糖含量成正比，吸光度越高提取效果越好）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 吸光度随乙醇提取浓度变化

以乙醇提取浓度为变量，保持其他实验条件不变，将乙醇提取浓度分别调节成70%、75%、80%、85%、90%5 个梯度，每组进行3 次平行测定，实验结果如图1。

图1 吸光度随乙醇提取浓度变化规律折线图

结果显示：当乙醇提取浓度在70%～80%范围内，吸光度随乙醇提取浓度的升高而升高；当乙醇提取浓度在80%～90%范围，吸光度达到最大且趋于稳定。

2.1.2 吸光度随冷藏温度变化

以冷藏温度为变量，保持其他实验条件不变，选取8 ℃、6 ℃、4 ℃、2 ℃、0 ℃、-2 ℃、-4 ℃共7个冷藏温度梯度，每组进行2次平行测定，实验结果如图2。

图2 吸光度随冷藏温度影响变化规律折线图

结果显示：吸光度随冷藏温度的降低而升高，当冷藏温度达到0 ℃时吸光度达到最高并趋于稳定。说明冷藏温度在0 ℃及以下时提取效果最佳。

2.1.3 吸光度随水提温度变化

以水提温度为变量，保持其他实验条件不变，选取40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃共9 个温度梯度，每组进行3 次平行测定，实验结果如图3。

图3 吸光度随水提温度变化规律折线图

结果显示：吸光度随水提温度的升高而升高，当水提温度升至70 ℃时达到最高并趋于稳定，说明水提温度在70 ℃及以上提取效果均较好，但是随温度的升高操作难度增大，综合考虑70 ℃为最佳提取温度。

2.2 正交试验

以上3 个单因素条件涉及醇沉与溶解两个步骤，影响醇沉的实验条件为乙醇提取浓度和冷藏温度；影响溶解的实验条件为水提温度，通过上述试验可确定最佳水提温度为70 ℃，现将醇沉步骤中的乙醇提取浓度和冷藏温度两个试验条件进行两因素三水平正交试验，试验设计如表1。

将表1中9组试验进行每组3次平行测定，试验结果如图4。

图4 乙醇提取浓度和冷藏温度正交试验结果对比

表1 乙醇提取浓度和冷藏温度两因素三水平正交试验设计

由正交试验结果可知：共9 组试验数据中，第2组、第5组、第9组提取效果均较好，但第2组标准偏差较小，试验结果准确性较高，所以第2组的试验条件应为最佳试验条件，即乙醇提取浓度为85%，冷藏温度为0 ℃。

综合单因素试验与正交试验可知，各试验的标准偏差均符合标准要求，说明试验准确可行；在醇沉步骤中配制酒多糖提取的最佳实验条件为乙醇提取浓度85%，冷藏温度0 ℃；在水溶提取步骤中最佳水提温度为70 ℃。

2.3 回收率试验

选取不含多糖的白酒样品与多糖标准品配制成多糖含量为500 mg/L 的多糖标准溶液，分别向A、B、C、D 组加入0.5 mL、2.5 mL、5 mL、10 mL 的500 mg/L 多糖标准溶液,用上述白酒样品定容至50 mL，配制成5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L 4 个浓度水平样品，每个浓度水平各做6 个平行，按照上述试验所得的最佳前处理条件进行试验，具体试验数据见表2。

从表2 可看出，4 个浓度水平的回收率为89.58 %～100.67 %，相对标准偏差为0.04 %～0.08%，均符合《中国药典2015 版9101 药品质量标准分析方法验证指导原则》中回收率限值及准确性的要求。

表2 配制酒多糖提取方法回收率及相对标准偏差

3 结论与展望

3.1 明确了配制酒多糖检测前处理中多糖提取的最佳实验条件为乙醇提取浓度85 %，冷藏温度0 ℃，水提温度70 ℃。对配制酒中多糖提取的实验条件进行了优化，在一定程度上完善了配制酒中的多糖检测方法。

3.2 从检验操作准确性角度考虑，明确具体的试验条件更能够保证检验结果的准确性。

3.3 随着保健型配制酒市场的日益壮大，消费者对于配制酒中有益成分的关注也越来越高，用科学的理论与实验方法积极完善配制酒检测方法，规范配制酒检测体系，是每一位检验工作者的责任，期待配制酒多糖检测国家标准或行业标准的出台。