TRAIL基因多态性及其血清水平与急性白血病的相关性研究

闫晓华，刘瑞磊，彭宝相，张纪云 ，孙运芳，程振娜

(1山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000；2临沂市人民医院；3临沂市肿瘤医院)

急性白血病(Acute leukemia，AL)分为急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia，AML)和急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)，是一类死亡率较高的血液系统恶性肿瘤。近年来，其发病率逐渐增高，主要诱发因素有物理、化学、生物及遗传因素等。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族成员，有研究显示其在肿瘤防御方面有一定作用。本研究探讨TRAIL与AL的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月—2020年5月本院就诊及住院的85例AL患者为AL组，其中男52例，女33例；年龄18～67岁，平均(41.1±11.9)岁；AML 51例，ALL 34例。纳入标准：均为原发性病变；采样前均未经放疗及化疗。另选同期来本院的体检者80例作为对照组，其中男50例，女30例，年龄18岁～65岁，平均(40.3±12.6)岁。纳入标准：对照组血常规、尿常规、粪便常规、生化检查、影像学检查均为正常。排除标准：两组均排除合并心、脑、肝、肾、肺及免疫性疾病患者。所有研究对象间无血缘关系，两组年龄、性别比等无统计学意义(P>0.05)，具可比性。所有参与研究者均经知情同意。

1.2方法

1.2.1标本采集 空腹采血4 ml分置2管中，其中1管为EDTA抗凝血2 ml，-20℃保存；另1管为肝素抗凝血2 ml，离心取血清，-20℃保存。

1.2.2仪器与试剂 PCR试剂、全血基因组DNA提取试剂盒(Tiangen 公司)，限制性内切酶(Tas I、Rsa I，Fermentas公司)，紫外显像系统(美国Bio-tech公司)。

1.2.3TRAIL基因多态性分析 ①基因组DNA的提取：按照试剂说明提取全血基因组DNA，提取产物通过核酸浓度检测仪和琼脂糖凝胶(EB)电泳验证。②PCR扩增目的基因片段：上游引物5′-AACATCTTCT-GTCTTTATAATC-3′，下游引物5′-AAATAACACGTACTTACTGAAG-3′(上海博亚公司)，扩增片段长度为484 bp，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳验证。③等位基因及基因型分析：基因测序：由于无法获得1588位点的限制性内切酶，因此所有PCR产物进行测序分析(上海生工生物工程有限公司)。PCR-RFLP法分析基因：随机抽取20份PCR产物限制性内切酶分析，并与测序结果比对。1525位点用Rsa I 酶切，1595位点用Tas I 酶切。酶切产物均用2.5%琼脂糖凝胶电泳及紫外显像系统分析。

1.2.4血清sTRAIL水平的检测 所有肝素抗凝标本离心取血清，使用ELISA法检测血清sTRAIL浓度。

2 结果

2.1Hardy-Weinberg平衡定律检验 TRAIL基因1525G/A、1588G/A、1595C/T位点基因型的理论分布频率采用直接计算法，期望值与观察值无统计学差异(χ2=0.449，P=0.799)，达到遗传平衡，说明实验所选样本具备群体代表性。

2.2TRAIL基因多态性 1525G/A位点经Rsa I酶切，电泳可见3组电泳条带：AA基因型(286、187、11 bp)、GA基因型(473、286、187、11 bp)和GG基因型(473、11 bp)，见图1；1595C/T位点经Tas I酶切，电泳出现3组电泳条带：CC基因型(291、193 bp)、CT基因型(291、193、131、62 bp)和TT基因型(291、131、62 bp)，见图2。所选样本酶切结果基因序列与测序结果一致，且均与GenBank序列一致。

A 图1 Rsa I酶切产物电泳图(1525位点)注：1.2000 bp DNA Marker；2.PCR产物；3.AA 基因型;4.PCR产物；5.2000 bp DNA Marker

B 图2 Tas I酶切产物电泳图(1595位点)注：1.CC基因型；2.CT基因型；3.TT基因型; 4.GA基因型；5.GG基因型

2.3两组基因型与等位基因的比较 AL组TRAIL基因第五外显子3＇-UTR区1525(G/A)、1588(G/A)、1595(C/T)三位点基因型和等位基因一致，即三位点突变情况完全一致；两组TRAIL基因第五外显子3’-UTR区1525(G/A)、1588(G/A)、1595(C/T)基因型及等位基因分布不一致。见表1。

表1 两组基因型与等位基因比较[ n(%)]

2.4两组血清sTRAIL水平比较 对照组血清sTRAIL水平高于AL组；按照白血病细胞系列归属分为AML组和ALL组，AML组血清sTRAIL水平与ALL组比较无统计学意义。见表2。

表2 两组血清sTRAIL水平比较

3 讨论

本研究显示AL组与对照组TRAIL基因的1525G/A、1588G/A及1595C/T基因型分布不同，AL组1525G、1588G及1595C等位基因频率明显高于对照组，提示TRAIL基因第五外显子3＇-UTR区携带1525G/1588G/1595C罹患AL的风险增高。AL组血清sTRAIL浓度明显高于对照组，AML组与ALL组之间比较无统计学差异。本研究结果与笔者以前对TRAIL在实体瘤中表达结果不一致[1-3]，提示实体瘤与血液恶性肿瘤发生发展的差异性。本研究AL患者血清TRAIL表达量升高，推测可能由于AL患者TRAIL死亡受体(DR)表达降低或其他诱导凋亡途径受阻，导致白血病细胞发生免疫逃逸。有研究认为，虽然TRAIL mRNA在AML原始细胞中表达上调，但由于自身表面死亡受体低表达，使AML原始细胞均对TRAIL抵抗，进而限制了TRAIL的诱导凋亡效应[4]。Cappellini A等[5]通过检测AML白血病细胞TRAIL受体发现，死亡受体DR4、DR5表达较少，而诱骗受体DcR-1、DcR-2高表达，因此引起肿瘤细胞发生免疫逃逸。目前，有关TRAIL与AL的研究多涉及如何结合药物提高TRAIL死亡受体的表达，诱导白血病细胞凋亡，起到治疗AL的目的[6-7]。

综上所述，通过本实验发现了TRAIL存在AL的易感基因及AL患者血清sTRAIL水平上升，对AL的早期预防及靶向治疗研究提供了实验依据。