丹皮酚预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

赵辉，赵伟，李素霞，王卫华，于淼

(1．菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000；2．菏泽市立医院，山东 菏泽 274013)

近年来缺血性脑卒中的发病率越来越高，严重威胁着人类的生命健康，脑缺血再灌注后继发性损伤对该类疾病的进展有着较大的影响，细胞凋亡是脑缺血再灌注后继发性损伤的主要原因[1-2]。研究发现，热休克蛋白(Hsp-70)、凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)与细胞凋亡有着密切的关系。脑缺血前给予药物预处理，在一定程度上可以减轻缺血再灌注损伤。丹皮酚是中药牡丹皮的主要活性成分，除了具有抗癌、保肝、神经保护、抗菌消炎、保护心血管等作用外，还具有脑保护作用[3]，但其作用机制尚无定论。本实验通过颈外动脉线栓法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，以药物预处理为出发点，观察丹皮酚对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，为临床上预防和治疗缺血性脑卒中提供理论依据和治疗思路。

1 材料

1.1 仪器 电热恒温水浴锅(DK-S26型，上海精宏实验设备有限公司)；自动双重纯水蒸馏仪(德SZ-93型，重庆光学仪器厂)；电子天平(BS 110S X型)、电子pH计(DELTA 320型)(德国Mettler Toledo公司)；DC200图像采集系统、Image-proplus5.0医学图像分析软件、光学显微镜、包埋机、切片机(德国Leica公司)；柯达图像分析系统(美国柯达公司)；低温高速离心机(美国BeekmanCoulter公司)。

1.2 药品与试剂 丹皮酚注射液(上海第一生化药业公司，批号：171201)；氯化三苯基四氮唑(TTC)、原位细胞凋亡检测(TUNEL)试剂盒、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒、兔抗鼠Hsp-70、Bcl-2、Bax抗体(武汉博士德有限公司)。

1.3 实验动物 3个月健康雄性SD大鼠60只，体重250～280 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SYXK(京)2017-0012。动物饲料、饮用水均消毒处理，室内温度、湿度恒定。

2 方法

2.1 分组与脑缺血再灌注损伤模型的制备 60只SD大鼠随机均分成3组，每组20只。造模前12 h，药物预处理组给予丹皮酚(100 mg·L-1)，模型组和假手术组给予等量生理盐水，均采用腹腔注射。模型组和丹皮酚预处理组采用颈外动脉线栓法并加以改良制作脑缺血再灌注损伤模型[4]。手术前大鼠禁食禁水10～12 h，腹腔注射10%水合氯醛(1 mL·kg-1)麻醉，将麻醉大鼠仰卧位固定于实验台上，颈部脱毛，切开颈部皮肤，分离出左侧颈总动脉、翼颚动脉、颈内动脉和颈外动脉，并将颈总动脉、翼颚动脉和颈外动脉结扎，同时在颈总动脉上切一个小口，采用直径约0.25 mm的高弹力碳素鱼线作为线栓，将线头蘸蜡制成约0.25 mm的光滑线头，然后蘸取肝素，从切口处轻柔推进插入线栓，使其沿颈内动脉入颅，进线约16～18 mm后如感到阻力即停止推送线栓，阻塞左侧大脑中动脉。血流阻断2 h后拔出线栓恢复血流，形成再灌注损伤模型。假手术组大鼠不结扎大脑中动脉血管，未做再灌注损伤处理。

2.2 神经功能评分 造模成功后，待大鼠清醒，按照Bederson评分标准进行神经功能缺损评分。具体评分标准如下：0级(0分)―大鼠无神经功能障碍；1级(1分)―提大鼠尾部，可见瘫痪侧肢体屈曲困难不能正常伸向地面；2级(2分)―除1级症状外，推瘫痪侧肢体时感觉阻力较另一侧明显减轻；3级(3分)―除1级症状外，大鼠在爬行时不自主地向瘫痪侧旋转；4级(4分)：大鼠伴有意识障碍。评分为0分、4分或死亡动物剔除，评分为1～3分，无蛛网膜下腔出血的动物才可进行实验。

2.3 标本采集 造模成功后，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉，将麻醉大鼠固定于手术台上，剪开胸腔露出心脏。采用心脏灌注固定方法取脑，制备约5 μm 厚度石蜡切片，用于检测大鼠脑梗死体积、海马细胞凋亡及Hsp-70、Bcl-2、Bax表达。

2.4 TTC染色法检测大鼠脑梗死体积 将脑组织切片用TTC进行染色，正常脑组织染成红色，梗死脑组织染成白色。然后将脑组织切片用甲醛的磷酸盐缓冲液固定。随后用计算机图像软件扫描脑组织切片，测量大鼠的脑梗死面积，进而换算出大鼠的脑梗死体积。

2.5 TUNEL法检测海马细胞凋亡 切片经TUNEL混合液37 ℃孵育2 h；POD转化剂37 ℃转化40 min后磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗；DAB显色；苏木精复染；脱水、二甲苯透明后封固切片。每张切片在400倍显微镜下取海马CA1区大致相同部位的6个互不重叠视野，观察并计数凋亡细胞数，凋亡细胞细胞核呈棕黄色染色。

2.6 免疫组化染色法检测海马细胞Hsp-70、Bcl-2及Bax蛋白的表达 大鼠造模成功后取尾状核平面切片，按常规免疫组化技术及试剂说明书要求分别进行Hsp-70、Bcl-2及Bax抗体染色。然后在光镜下观察，HSP-70阳性细胞位于细胞质与细胞核中，均呈蓝色，尤其以细胞核周围最为明显。Bcl-2及Bax阳性细胞仅位于细胞质，Bcl-2阳性细胞呈褐色或者棕黄色，均匀弥漫样染色；Bax阳性细胞呈蓝色，核淡染色；每张切片在400倍光镜下取出血灶边缘相互不重叠的6个视野，观察并计数切片的阳性细胞总数量。

3 结果

3.1 各组大鼠神经功能缺损和脑梗死体积比较 脑缺血再灌注损伤后，模型组及丹皮酚预处理组大鼠出现神经功能缺损、梗死灶等表现。与模型组比较，丹皮酚预处理组大鼠神经功能评分和脑梗死体积明显减少(P<0.05)，结果见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分和脑梗死体积

3.2 各组大鼠海马组织细胞凋亡水平比较 假手术组大鼠大脑皮质区域内未见TUNEL阳性细胞。脑缺血再灌注损伤后，模型组及丹皮酚预处理组大鼠脑缺血再灌注周围皮质区域内出现TUNEL阳性细胞。与模型组比较，丹皮酚预处理组TUNEL阳性细胞数明显减少(P<0.05)，结果见表2、图1。

A.模型组TUNEL阳性细胞数；B.丹皮酚预处理组TUNEL阳性细胞数

3.3 各组大鼠HSP-70、Bcl-2及Bax阳性细胞数比较 脑缺血再灌注损伤后，模型组及丹皮酚预处理组海马细胞周围Bcl-2、Bax、Hsp-70阳性细胞数发生了变化。与模型组比较，丹皮酚预处理组Bax阳性细胞数明显减少，Hsp-70及Bcl-2阳性细胞数明显增加(P<0.05)，结果见表2、图2。

表2 各组大鼠Hsp-70、Bcl-2、Bax阳性细胞数(n=10，个/视野，

图2 各组大鼠Hsp-70、Bcl-2、Bax阳性细胞数(免疫组化染色，×400)

4 讨论

缺血性脑血管病尤其是脑缺血后再灌注损伤对身体危害极大，脑缺血后局部血流受阻可导致脑细胞迅速死亡，快速恢复缺血部位脑组织的血供是防止脑细胞损伤的首要条件，但是再灌注之后恢复血流同时也可能会进一步加重缺血性损伤，即缺血再灌注损伤[5]。细胞凋亡在缺血再灌注损伤中起着重要作用。目前研究的热点是通过减轻神经细胞凋亡，从而达到治疗的目的[6]。研究发现，Hsp-70、Bcl-2及Bax与细胞凋亡有着密切的关系。Bcl-2与Bax是一组调控细胞凋亡的竞争性蛋白，Bcl-2具有抑制细胞凋亡、促进细胞存活的作用；Bax具有促进细胞凋亡及死亡的作用，Bax减少或Bcl-2增多均可能与神经细胞凋亡有关[7]。Hsp-70是一类应激性保护蛋白。在脑缺血情况下，Hsp-70可作为应激反应的一个可靠标志物，其神经保护作用可能与抑制细胞凋亡、促进蛋白质正确折叠等作用有关；另外，Hsp-70还可以维持细胞内环境的稳定、提高神经组织对脑缺血的耐受。现已公认Hsp-70为脑缺血性损伤中具有保护作用的蛋白，在促进脑细胞修复、脑缺血损伤恢复等过程中起着重要作用[8]。

丹皮酚又称牡丹酚，是毛茛科植物牡丹根皮的主要有效单体成分。具有抗癌、保肝、神经保护、抗菌消炎、保护心血管等药理作用。作为具有多种药理作用的传统中药，逐渐引起医药界的重视。已有文献报道，丹皮酚通过抑制兴奋性氨基酸的毒性作用，抗自由基缺损，阻止钙离子内流等机制对脑缺血具有一定的保护作用[9-11]。本实验结果显示，脑缺血再灌注损伤后，大鼠出现神经功能缺损、梗死灶等表现，与模型组比较，丹皮酚预处理组，大鼠脑梗死灶缩小、神经功能缺损有所改善，说明丹皮酚起到了脑神经的保护作用。实验进一步证实了脑缺血再灌注损伤后，脑缺血再灌注海马细胞周围TUNEL阳性细胞数和Bcl-2、Bax、Hsp-70蛋白表达发生了变化，说明细胞凋亡机制参与了脑缺血再灌注损伤，与模型组比较，丹皮酚预处理组，TUNEL阳性细胞数和Bax蛋白的表达减少，而Bcl-2和Hsp-70蛋白的表达增加，说明丹皮酚能有效上调Hsp-70、Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，抑制神经细胞凋亡，减轻脑组织损伤。这为缺血性脑卒中的二级预防治疗，颈动脉狭窄解除、颅脑损伤、颅内占位切除等术前治疗后的预后改善提供了新的途径，也为临床上缺血性脑卒中的治疗提供了一定的参考。

综上所述，在脑缺血再灌注损伤前给予丹皮酚预处理能有效改善脑组织损伤，其机制可能与上调Hsp-70、Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，减轻脑缺血再灌注损伤后的神经细胞凋亡有关。除此之外，丹皮酚是否通过其他途径对损伤的脑神经起到一定的保护作用，还需进一步深入研究。