七氟烷预处理后对大鼠脑缺血的神经保护作用

廖春英　袁建清　李志刚

摘要：目的 观察七氟烷预处理对大鼠缺血性脑损伤的神经保护作用。方法 将SD大鼠分为实验组、对照组和假手术组，七氟烷预处理实验组大鼠后，实验组和对照组建立局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO），24 h后各组进行神经功能缺损评估、测量脑梗死面积，MCAO 3d后TUNEL法检测细胞凋亡。结果 实验组神经功能缺损评分明显低于对照组（P<0.05），实验组脑缺血损伤面积明显小于对照组（P<0.05），MCAO 3d 后实验组TUNEL阳性细胞明显少于对照组（P<0.05）。结论 七氟烷预处理对于缺血性脑损伤有神经保护作用。

关键词：七氟烷；预处理；脑缺血；神经保护

Abstract：Objective To investigate the neuroprotection of sevoflurane preconditioning for local cerebral ischemia. Methods 36 two-month old Sprague-Dawley male rats were randomly divided into sham group， experimental group and control group. Experimental group was exposed to sevoflurane for 30 min/day on 4 consecutive days and then underwent a 60 min middle cerebral arterial occlusion （MCAO）， while control group underwent MCAO only. At 24 h after reperfusion all the groups were investigated by neurological severity score （NSS） for neurological deficits， TTC staining for infarct percentage， TUNEL was performed to determine the percentage of cell death after MCAO 3d. Results The NSS score and infarct percentage in experimental group decreased significantly compared with those of control group at 24 h after reperfusion （P< 0.05）， The percentage of TUNEL positive cells of experimental group was reduced significantly compared to that of control group at 3 d after reperfusion （P< 0.05）. Conclusion Sevoflurane preconditioning provides neuroprotection against local cerebral ischemia.

Key words：Sevoflurane；Preconditioning；Cerebral Ischemia；Neuroprotection

缺血性腦损伤是一种致死率、致残率极高的常见病，研究治疗缺血性脑损伤的有效措施和药物，是近年来医学研究的一大热点。近期有研究通过细胞培养和大鼠脑片电生理等离体实验表明[1]，一种临床上常用的挥发性麻醉药七氟烷（sevoflurane），在脑缺氧中具有神经保护作用，本研究通过七氟烷预处理大鼠后建立局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO），进行神经功能缺损评估、测量脑梗死面积、TUNEL法检测细胞凋亡，在体研究来观察七氟烷预处理脑缺血后神经保护作用。

1 资料与方法

1.1实验动物与分组 成年（月龄2个月）健康雄性SD大鼠36只，体质量250～300 g，由赣南医学院动物实验中心提供。随机分为实验组、对照组和假手术组，每组各12只。

1.2七氟烷预处理 实验组进行1次/d七氟烷处理，将大鼠放入麻醉呼吸箱（Drager公司）中，保持清醒呼吸状态，吸入1.0最小肺泡浓度（Minimum Alveolar Concentration， MAC）七氟烷（2.4%七氟烷/空气）30 min，对照组和假手术组吸入100%空气，连续4 d，最后1次预处理完毕后24 h，进行MCAO模型制备。动物吸入七氟烷期间的监测生理指标pH、PaCO2、PaO2和肛温（℃），保证生理参数在正常范围。

1.3 MCAO模型建立 应用线栓法建立MCAO[2]模型，用6%水合氯醛麻醉（300 mg·kg-1体质量），术中维持动物直肠温度（37±0.5）℃。分离并结扎右侧颈总动脉、颈外动脉，注意避免刺激迷走神经。于颈总动脉近颈内动脉、颈外动脉分叉处剪一小口，插入一前端5 mm涂以硅胶的4-0丝线进入颈内动脉，深度为距离颈总动脉分叉处1.8～2.0 cm，1 h后拔出丝线进行再灌注。假手术组除不插线栓外余步骤同上。术后在约20℃的空调环境下单笼饲养，自由进水、进食。

1.4神经功能缺损评分 各组MCAO后24 h通过双盲法（两人评分，取二者平均值）进行功能缺损评分，评分标准[3]：0分，无神经功能缺损；1分，不能完全伸直右侧前爪；2分，向右侧转圈；3分，向右侧倾倒；4分，无自动活动伴有意识障碍；5分，死亡。

1.5氯化三苯基四氮唑（triphyl tetrazolium chloride，TTC）染色法测定脑梗死面积 各组MCAO后24 h随机取6只断头取脑，自视交叉前4 mm开始连续冠状面冰冻切片（2 mm厚），共取6片，置于2%TTC（Sigma公司）染色中，37℃避光孵育20 min，存活组织深红，坏死组织呈白色，数码相机（DSC-T300，SONY）将每张组织照相，输入计算机，用图像处理软件（Image Tool）进行不显色部分面积分析，并计算梗死面积[4- 5]：梗死面积%=[（∑缺血对侧面积×2mm-∑缺血同侧未梗死面积×2mm）/∑对侧面积×2mm]×100%。

1.6 TUNEL法检测细胞凋亡 各组MCAO后3 d 随机取6只断头取脑，-20℃恒冷切片机自视交叉处开始，行10 μm厚连续冠状切片。TUNEL染色严格按照TUNEL试剂盒（美国Milipore公司）说明书步骤操作。Olympus BX51荧光显微镜下观察细胞凋亡情况，每张片子随机取5个视野，同一曝光条件下照相，并计算TUNEL阳性细胞百分比。

1.7统计学处理 所得数据用（x±s）差表示，采用SPSS 17.0统计软件进行分析，两组间比较采用t检验，P<0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1神经功能缺损程度评估 建模前各组大鼠评分为0分，建模后24 h评分：假手术组评分无变化，为0分，实验组评分为（1.5±0.7）分，对照组评分为（3.5±0.7）分，实验组评分明显低于对照组（P<0.05）。

2.2各组大鼠MCAO后脑梗死面积的比较 假手术组无明显脑梗死发生，实验组脑梗死的面积比率为（16.58±5.88）%，较对照组脑梗死的面积比率（31.98±10.14）%明显减少（P<0.05）。

2.3七氟烷预处理对脑缺血后细胞凋亡的影响 假手术组可见极少数TUNEL阳性细胞（1.27±0.25）%，MCAO 3d 后实验组TUNEL阳性细胞（8.25±1.40）%明显少于对照组（31.45±2.42）%（P<0.05）。

3 讨论

缺血性脑损伤是一种致死率、致残率极高的多发病、常见病，且易再发和复发，严重危害人类身心健康。研究治疗缺血性脑损伤的有效措施和藥物，是近年来医学研究的一大热点[6]。七氟烷（sevoflurane）是一种临床上常用的挥发性麻醉药，可增加脑血流量，降低脑的氧代谢率[7]，近期有研究通过离体细胞培养和大鼠脑片电生理实验表明，这种吸入性麻醉药七氟烷，在脑缺血中具有神经保护作用[1，8-10]。

本研究通过七氟烷预处理大鼠后建立MCAO再灌注模型，进行神经功能缺损评估、测量脑梗死面积，TUNEL法检测细胞凋亡，结果显示：实验组神经功能缺损评分明显低于对照组（P<0.05）；实验组脑梗死的面积比率较对照组明显减少（P<0.05），MCAO 3d 后实验组TUNEL阳性细胞明显少于对照组（P<0.05）。在体研究证实了七氟烷预处理脑缺血后的神经保护作用。但其作用的具体机制尚不清楚，可能对脑血流量、脑代谢、炎症因子及其相关信号传导产生一定影响[11]。有研究认为七氟烷可激活KATP，抑制缺血期神经元的钙离子和兴奋性氨基酸浓度的升高[11]；减少NF-kB入核，降低其转录调控的炎症因子如COX-2、iNOS、TNFa、IL-1、IL-6等来抑制炎症反应[12]；抑制脑缺血后的细胞凋亡[13]，从而发挥神经保护作用。

最近，国外通过细胞培养离体研究表明，双孔钾通道TREK-1参与了七氟烷预处理在脑缺血中的神经保护作用。TREK-1是一种新型的双孔钾离子通道亚型，可被机械牵张、多聚不饱和脂肪酸（如花生四烯酸、AA）、溶血磷脂和一些挥发性麻醉药如氟烷、七氟烷、乙醚、氙气等激活[14]。TREK-1广泛表达于大鼠海马、皮层，其活性可影响脑缺血时星形胶质细胞的增殖活化以及平衡缓冲功能[15-16]。 TREK-1通道开放后，表达具有线性I-V关系的背景钾电流，在细胞膜静息电位的形成和膜电位的复极化中起着重要作用，能稳定膜电位，调节细胞的兴奋性，使细胞膜超极化，减少钙离子内流，降低谷氨酸的转运和兴奋性细胞毒性[14]。

本实验通过七氟烷预处理大鼠后建立MCAO再灌注模型，进行神经功能缺损评估、测量脑梗死面积，TUNEL法检测细胞凋亡，在体研究证实了七氟烷预处理脑缺血后的保护作用，为进一步研究其神经保护作用的机制提供了实验基础。

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编辑/金昊天