番石榴叶乙醇提取物的化学成分研究

2021-08-19陈欣怡黄积武李创军马洁臧应达张东明

药学研究 2021年7期

陈欣怡，黄积武，李创军，马洁，臧应达，张东明

(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050)

番石榴(PsidiumguajavaLinn.)为桃金娘科(Myrtaceae)番石榴属(Psidium)植物，原产于美洲热带，在我国广东、广西、福建等省均有栽培[1]。番石榴中化学成分种类丰富，近年来研究发现，番石榴中含有混源萜、三萜、黄酮、鞣质、胡萝卜素等多种类型的化合物[2]。番石榴叶及果实具有一定的食用价值，同时也具有出色的药用价值。目前药理研究表明，番石榴具有降血糖[3]、降血脂[3]、抗菌[4]、抗病毒[5]、抗炎[6]、抗肿瘤[7]、肝保护[8]等多种药理作用。为了充分开发利用番石榴叶的药用价值，对番石榴叶的化学成分进行了研究，从中分离鉴定了十个化合物，分别为:guajadial(1)、psiguajadial G(2)、guajadial C(3)、psiguajadial E(4)、physcion(5)、4-methoxy-6-phenyl-2H-pyran-2-one(6)、(6S,8R)-loliolide(7)、teuhetenone A(8)、(R)-(-)-mellein methyl ether(9)、2-羟基苯甲酸苄酯(10)。化合物结构见图1。化合物1～4为混源萜类化合物，5～10为首次从番石榴叶中分离得到。

图1 化合物1～10结构

1 样品来源与鉴定

药材采摘自广西壮族自治区桂林市，经中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所马林副研究员鉴定为番石榴(PsidiumguajavaL.)叶。标本保存在中国医学科学院药物研究所标本室(ID-22163)。

2 仪器与材料

2.1 仪器 Buchi Rotavapor R-300型旋转蒸发仪；Themo Q Exactive Focus组合型四极杆Orbitrap质谱仪；Bruker AVANCE-III 500 MHz核磁共振波谱仪；Bruker AVANCE-III HD 600 MHz核磁共振波谱仪；Agilent 1100型高效液相色谱；Buchi C-600中压液相色谱仪；Shimadzu LC-16P双波长制备液相色谱；Agilent Xcalibur Eos Gemini X射线单晶衍射仪。

2.2 材料 ODS填料(北京金欧亚科技发展有限公司和北京慧德易)；硅胶板(烟台化学工业研究所)；乙腈和甲醇(色谱纯，美国Fisher、TEDIA公司)；有机试剂：石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇等(均为国产分析纯)。

3 提取和分离

取番石榴干燥叶40 kg，粉碎过筛后，用95%乙醇进行加热回流提取两次，合并95%乙醇提取液，过滤并减压得到浸膏。浸膏加水用二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，减压浓缩蒸干，得到浸膏3.0 kg，将浸膏与4.0 kg硅胶拌样后，进行硅胶柱层析，依次用石油醚(30 L)、石油醚-丙酮混合溶剂(20∶1、5∶1各30 L)、二氯甲烷-甲醇(1∶1，20 L)混合溶剂进行洗脱，分别得到Fr.1～4。

组分Fr.1(320 g)经聚酰胺柱(乙醇∶水50∶50→95∶5)洗脱，最后用石油醚冲柱，得到Fr.1A～Fr.1D，Fr.1B经硅胶柱(环己烷∶二氯甲烷7∶1→0∶1)洗脱，最后用二氯甲烷∶甲醇=1∶1冲柱，得到Fr.1B1～Fr.1B8，Fr.1B3经ODS制备柱、ODS半制备柱纯化得到化合物10(7 mg)。Fr.1B5用中压液相色谱分离，用甲醇-水体系进行梯度(88∶12→100∶0)洗脱，得到Fr.1B51～Fr.1B548，Fr.1B547析出无色针状晶体(27 mg)，过滤后用氯仿-甲醇溶剂(1∶1)重结晶，得到无色块状晶体为化合物1。Fr.1B6进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯体系进行梯度(50∶1→2∶1)洗脱，得到Fr.1B61～Fr.1B634，Fr.1B65经制备液相色谱进行纯化(纤维素-4手性半制备柱)，得到化合物3(3 mg)。Fr.1B68用纤维素-4手性半制备柱分离，再用苯基制备柱纯化，得到化合物2(1.0 mg)和化合物4(6.0 mg)。

组分Fr.2(400 g)经MCI柱(乙醇∶水 60∶40→95∶5)洗脱，后又经硅胶柱(石油醚∶丙酮50∶1 → 10∶1)洗脱，后经ODS制备柱、ODS半制备柱纯化得到化合物5。

组分Fr.3(230 g)经MCI柱(甲醇∶水10∶90→100∶0)洗脱，得到Fr.3A～Fr.3H。Fr.3D(11.7 g)经硅胶柱(环己烷∶二氯甲烷4∶1→1∶1)洗脱，得到Fr.3D1～Fr.3D14，Fr.3D3+4经开放ODS制备柱，用甲醇-水进行梯度(40∶60→100∶0)洗脱，得到Fr.3D3-1～Fr.3D3-17。Fr.3D3-5(114 mg)用制备液相色谱分离(ODS制备柱)，用ODS半制备柱纯化，得到化合物6～9。

4 结构鉴定

化合物1：无色块状晶体(氯仿∶甲醇=1∶1)，HRESIMSm/z475.247 8([M +H]+,C30H35O5,计算值 475.247 9),[α]20 D=-8.8(c0.6,丙酮)、[α]20 D=-30.1(c0.375,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：1.01(3H,s,H-12)，0.98(3H,s,H-13)，1.26(3H,s,H-14)，4.54(1H,s,H-15a)，4.04(1H,s,H-15b)，10.09(1H,s,H-14′)，10.06(1H,s,H-15′)，13.44(1H,s,H-5′-OH)，13.05(1H,s,H-7′-OH)，7.12(2H,d,J=7.5 Hz,H-10′/12′)，7.18(1H,s,H-11′)，7.24(2H,m,H-9′/13′)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：41.3(C-1)，53.2(C-2)，22.2(C-3)，37.1(C-4)，84.3(C-5)，43.4(C-6)，30.4(C-7)，35.4(C-8)，150.6(C-9)，36.7(C-10)，33.8(C-11)，30.4(C-12)，22.0(C-13)，21.2(C-14)，110.2(C-15)，43.4(C-1′)，105.5(C-2′)，163.4(C-3′)，104.1(C-4′)，168.3(C-5′)，104.3(C-6′)，169.5(C-7′)，143.7(C-8′)，128.7(C-9′/13′)，127.9(C-10′/12′)，126.1(C-11′)，192.0(C-14′)，191.5(C-15′)。以上数据与文献报道的guajadial[2]一致。此外，化合物1在氯仿-甲醇混合溶剂(1∶1)中培养得到高质量单晶，经X-射线单晶衍射方法进一步确证了化合物1的绝对构型(见图2)，晶体尺寸：0.280×0.250×0.240 mm3。铜靶辐射波长 (λ=1.541 84 Å)。衍射点收集9 751。独立衍射点4 232[Rint=0.023 0 (inf-0.9Å)]，空间群P21，晶胞棱边长a=6.544 2(3) Å,b=17.482 7(7) Å,c=10.671 6(4) Å，晶胞棱间夹角α=90°,β=90.618(4)°,γ=90°，单斜晶，T=111.3(2) K。对于可观测衍射点的残差因子R值 [I> 2σ(I)],R1=0.074 4,wR2=0.189 7。对于全部衍射点的残差因子R：R1=0.075 4,wR2=0.190 9。Flack常数 0.02(9)。晶体完整性0.998 7。CCDC号: 1966573。

图2 化合物1的X-单晶衍射图

化合物2：白色粉末，HRESIMSm/z497.230 2([M + Na]+,C30H34O5Na，计算值 497.229 8)，[α]20 D =-23.0(c0.1,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：0.99(3H,s,CH3-12)，0.96(3H,s,CH3-13)，1.05(3H,s,CH3-14)，4.89(1H,s,H2-15a)，4.81(1H,s,H2-15b)，7.11(1H,d,J=7.0 Hz)，7.23(3H,m)，10.11(1H,s,H-14′)，10.15(1H,s,H-15′)，13.63(1H,s,H-5′-OH)，13.21(1H,s,H-7′-OH)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：42.6(C-1)，57.8(C-2)，23.2(C-3)，42.3(C-4)，86.1(C-5)，39.0(C-6)，27.7(C-7)，36.1(C-8)，154.2(C-9)，37.6(C-10)，33.5(C-11)，29.6(C-12)，22.6(C-13)，22.9(C-14)，110.3(C-15)，35.8(C-1′)，103.7(C-2′)，164.2(C-3′)，103.8(C-4′)，103.7(C-5′)，103.6(C-6′)，168.8(C-7′)，139.2(C-8′)，130.2(C-9′)，127.8(C-10′)，126.7(C-11′)，127.8(C-12′)，130.2(C-13′)，191.5(C-14′)，192.2(C-15′)。以上数据与文献报道的psiguajadial G[1]一致，故鉴定化合物2为psiguajadial G。

化合物3：淡黄色粉末，HRESIMSm/z475.247 6([M + H]+,C30H35O5，计算值 475.247 9)，[α]20 D=+126.0(c0.2,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：0.58(3H,d,J=6.0 Hz,CH3-12)，0.88(3H,d,J=6.0 Hz,CH3-13)，0.91(3H,d,J=7.0 Hz,CH3-15)，5.34(1H,s,H-2)，7.15(2H,d,J=7.0 Hz )，7.21(1H,m,1H)，7.28(2H,m)，10.11(1H,s,H-14′)，10.12(1H,s,H-15′)，13.57(1H,s,H-5′-OH)，13.16(1H,s,H-7′-OH)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：78.1(C-1)，125.5(C-2)，147.9(C-3)，50.6(C-4)，22.1(C-5)，28.7(C-6)，33.1(C-7)，37.7(C-8)，22.0(C-9)，30.9(C-10)，27.0(C-11)，21.5(C-12)，21.2(C-13)，43.7(C-14)，14.3(C-15)，34.6(C-1′)，102.8(C-2′)，164.6(C-3′)，104.6(C-4′)，168.6(C-5′)，104.1(C-6′)，169.8(C-7′)，144.7(C-8′)，126.8(C-9′)，128.6(C-10′)，126.3(C-11′)，128.6(C-12′)，126.8(C-13′)，192.4(C-14′)，191.6(C-15′)。以上数据与文献报道的guajadial C[1]一致，故鉴定化合物3为guajadial C。

化合物4：无色油状物，HRESIMSm/z497.230 4([M + Na]+,C30H34O5Na，计算值 497.229 8)，[α]20 D =-109.0(c0.2,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：1.23(3H,s,CH3-12)，1.17(3H,s,CH3-13)，1.13(3H,s,CH3-14)，1.08(3H,s,CH3-15)，4.90(1H,d,J=8.5 Hz,H-1)，10.07(1H,s,H-14′)、10.19(1H,s,H-15′)，13.74(1H,s,H-5′-OH),13.05(1H,s,H-7′-OH)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：127.1(C-1)，131.3(C-2)，37.7(C-3)，23.4(C-4)，32.7(C-5)，28.5(C-6)，80.0(C-7)，40.9(C-8)，40.0(C-9)，24.3(C-10)，19.4(C-11)，19.9(C-12)，30.5(C-13)，26.1(C-14)，18.1(C-15)，48.6(C-1′)，105.7(C-2′)，163.0(C-3′)，103.6(C-4′)，168.6(C-5′)，104.0(C-6′)，168.8(C-7′)，142.8(C-8′)，128.7(C-9′)，126.9(C-10′)，126.9(C-11′)，126.9(C-12′)，128.7(C-13′)，192.7(C-14′)，191.4(C-15′)。以上数据与文献报道的psiguajadial E[1]一致，故鉴定化合物4为psiguajadial E。

化合物5：橙色粉末，HRESIMSm/z283.061 5([M-H]-,C16H11O5，计算值 283.061 2)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：12.45(3H,s,CH3-15)，3.94(3H,s,CH3-16)，7.08(1H,s,H-2)，7.63(1H,s,H-4)、7.37(1H,d,J=2.0 Hz,H-5)，6.69(1H,d,J=2.0 Hz,H-7)，12.31(1H,s)，12.11(1H,s)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：162.5(C-1)，124.5(C-2)，148.4(C-3)，121.3(C-4)，108.2(C-5)，166.5(C-6)，106.8(C-7)，165.2(C-8)，190.8(C-9)，182.0(C-10)，133.2(C-11)，113.7(C-12)，110.2(C-13)，135.2(C-14)，22.2(C-15)，56.1(C-16)。以上数据与文献报道的physcion[2]一致，故鉴定化合物5为physcion。

化合物6：无色柱状晶体，HRESIMSm/z203.070 3([M + H]+,C12H11O3，计算值203.070 3)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：3.87(3H,s,CH3-1′′)]，5.55(1H,s,H-3)，6.43(1H,s,H-5)，7.81(2H,s,H-2′/H-6′)，7.46(3H,overlap,H-3′/H-4′/H-5′)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：164.2(C-2)，88.5(C-3)，171.3(C-4)，98.0(C-5)，160.2(C-6)，131.1(C-1′)，125.7(C-2′)，128.9(C-3′)，131.0(C-4′)，128.9(C-5′)，125.7(C-6′)，56.0(C-1′′)。以上数据与文献报道的4-methoxy-6-phenyl-2H-pyran-2-one[2]一致，故鉴定化合物6为4-methoxy-6-phenyl-2H-pyran-2-one。

化合物7：无色方晶(氯仿)，HRESIMSm/z197.117 3([M + H]+,C11H17O3，计算值 197.117 2)，[α]20 D =-93.3(c0.445,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：1.27(3H,s,CH3-9)，1.47(3H,s,CH3-10)，1.79(3H,s,CH3-11)，5.69(1H,s,H-2)。13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δC：182.8(C-1)，112.8(C-2)，172.1(C-3)，36.0(C-4)，45.6(C-5)，66.7(C-6)，47.3(C-7)，86.9(C-8)，30.7(C-9)，26.5(C-10)，27.0(C-1)。以上数据与文献报道的(6S,8R)-loliolide[12]一致。此外，化合物7在氯仿中培养得到单晶，经X-射线单晶衍射方法进一步确证了化合物7的绝对构型(见图3)，晶体尺寸：0.410×0.370×0.230 mm3。铜靶辐射波长(λ=1.541 84 Å)。衍射点收集3 059。独立衍射点1 915 [Rint=0.023 6 (inf-0.9Å)]，空间群P21，晶胞棱边长a=5.993 6(11) Å,b=11.574 4(14) Å,c=7.812(2) Å，晶胞棱间夹角α=90°,β=190.10(2)°,γ=90°，单斜晶，T=111(4) K。对于可观测衍射点的残差因子R值 [I> 2σ(I)],R1=0.036 6,wR2=0.092 8。对于全部衍射点的残差因子R值：R1=0.038 3,wR2=0.094 4。Flack常数0.03(15)。晶体完整性0.999 0。CCDC号: 2072802。

图3 化合物7的X单晶衍射图

化合物8：无色油状物，HRESIMSm/z195.138 0([M + H]+,C12H19O2，计算值 195.138 0)，[α]20 D=+110.9(c0.23,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：1.32(3H,s,CH3-11)，1.43(3H,s,CH3-12)，6.35(1H,s,H-2)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：200.4(C-1)，122.5(C-2)，175.0(C-3)，72.4(C-4)，42.5(C-5)，19.5(C-6)，40.6(C-7)，36.2(C-8)，34.0(C-9)，40.9(C-10)，29.6(C-11)，24.5(C-12)。以上数据与文献报道的teuhetenone A[1]一致，故鉴定化合物8为teuhetenone A。

化合物9：白色粉末，HRESIMSm/z193.085 9([M + H]+,C11H13O3，计算值193.085 9)，[α]20 D =-190.0(c0.031 5,氯仿)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：1.48(3H,d,J=6.0 Hz,CH3-10)]，3.95(3H,s,CH3-11)，6.92(1H,d,J= 8.0 Hz,H-4)，7.45(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5)，6.80(1H,d,J= 8.0 Hz,H-6)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：162.7(C-1)，113.7(C-2)，161.2(C-3)，110.9(C-4)，134.4(C-5)，119.1(C-6)，141.0(C-7)，36.1(C-8)，74.1(C-9)，20.7(C-10)，56.2(C-11)。以上数据与文献报道的(R)-(-)-mellein methyl ether[1]一致，故鉴定化合物9为(R)-(-)-mellein methyl ether。

化合物10：油状物，HRESIMSm/z229.085 9([M + H]+,C14H13O3，计算值229.085 9)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δH：10.76(1H,s,C-2-OH)，6.99(1H,dd,J=8.0,1.0 Hz,H-3)，7.46(1H,m,H-4)，6.87(1H,td,J=8.0,1.0 Hz,H-5)，7.89(1H,dd,J=8.0,1.0 Hz,H-6)，7.45(1H,m,H-2′/H-6′)，7.41(3H,overlap,H-3′/H-4′/H-5′)。13C-NMR(CDCl3，125 MHz)δC：112.3(C-1)，161.7(C-2)，117.6(C-3)，135.8(C-4)，119.2(C-5)，130.0(C-6)，169.9(C-7)，135.3(C-1′)，128.3(C-2′)，128.5(C-3′)，128.7(C-4′)，128.5(C-5′)，128.3(C-6′)，67.0(C-7′)。以上数据与文献报道的2-羟基苯甲酸苄酯[15]一致，故鉴定化合物10为2-羟基苯甲酸苄酯。