3 种婴幼儿配方乳粉不同贮藏条件下维生素K1含量比较

胡冬梅，王 芳，陈 忱

北大荒完达山乳业股份有限公司质检中心，黑龙江哈尔滨 150078

0 引言

维生素K1是一种脂溶性维生素，在空气和潮湿环境下较稳定，但在阳光下易被分解。维生素K1在天然绿色植物中广泛存在，有多种生理功能和作用，主要包括抗出血、防止骨质疏松、防治偏头痛、防治胃肠道疾病等[1～3]。

维生素K1对婴幼儿成长非常重要。婴幼儿缺乏维生素K1，可能会导致先天性失明。维生素K1缺乏症是一种获得性、复合性、出血性疾病，由维生素K1缺乏引起，以有出血倾向、凝血因子缺乏或减少为特征。母乳中维生素K1的含量略低，新生儿生长发育快，对维生素K1需要量较大，容易摄入不足，需要额外通过药物补充。故婴幼儿配方乳粉（以下简称“婴配粉”）中需要添加维生素K1来补充婴幼儿成长所需的营养元素[4～7]。

目前对婴配粉中脂溶性维生素含量研究主要集中检测方法上，本文通过对比3 种不同的婴配粉的贮存条件对含量的影响，进一步弥补维生素K1研究方法的空缺。本文采用《GB 5009.158—2016 食品安全国家标准 食品中维生素K1的测定》第一法高效液相色谱-荧光检测法进行比较三种婴配粉中脂溶性维生素K1在贮存过程中的稳定性，在不同温度贮存条件下维生素K1含量变化。试样经脂肪酶和淀粉酶酶解，正己烷提取样品中的维生素K1后，用C18液相色谱柱将维生素K1与其他杂质分离，锌柱柱后还原，荧光检测器检测，外标法定量。通过数据对比，优化贮存条件对脂溶性维生素K1含量的影响[8～12]。

1 材料与方法

1.1 仪器与标准品

1.1.1 仪器

高效液相色谱仪（荧光检测器） Perkin Elmer ；水浴磁力恒温搅拌器 常州华奥仪器制造有限公司；萃取净化振荡器 北京同泰联科技发展有限公司；旋转蒸发仪IKA；氮吹仪 北京同泰联科技发展有限公司；涡旋混合器IKA 。

1.1.2 维生素K1标准品

购买经国家认证并授予标准物质证书的维生素K1标准品（CAS号：84-80-0，纯度≥99%）；维生素K1储备液：浓度C=1.0 mg/mL；维生素K1工作液：浓度分别为0.100 0 μg/mL，0.200 0 μg/mL，0.300 0 μg/mL，0.400 0 μg/mL，0.500 0 μg/mL，0.600 0 μg/mL。

1.2 试剂

40%氢氧化钾溶液；磷酸盐缓冲液（pH值=8.0）；流动相：量取甲醇900.0 mL，四氢呋喃100.0 mL，冰乙酸0.3 mL，混匀后，加入氯化锌1.50 g，无水乙酸钠0.50 g，超声溶解后，用0.22 μm有机系滤膜过滤。

1.3 试验方法

随机选取超市3 种不同品牌的婴配粉（0～6个月），每个品牌选4 个样品，共计12 个样品，在阴凉干燥处（5 ℃）、常温（20 ℃）、低温（-18 ℃）及高温（30 ℃）4 种贮存条件下，分别贮存4 周，每周测定1 次维生素K1含量变化。

1.4 样品前处理与测定

1.4.1 样品处理

（1）酶解

准确称取经均质的试样2.50 g（精确到0.01 g，维生素K1含量不低于0.05 μg）于50.0 mL离心管中；加入5.0 mL温水溶解，加入磷酸盐缓冲液（pH值=8.0）5.0 mL，混匀；加入0.20 g脂肪酶和0.20 g淀粉酶（不含淀粉的样品可以不加淀粉酶）；加盖，涡旋2～3 min，混匀后，置于摇床振荡器中振荡2 h以上，使其充分酶解。

（2）提取

取出酶解好的试样，分别加入10.0 mL乙醇及1.00 g碳酸钾，混匀后加入10.0 mL正己烷和10.0 mL水，涡旋振荡，将酶解液转移至150.0 mL的分液漏斗中萃取提取，静置分层（如发生乳化现象，可适当增加正己烷或水的加入量，以排除乳化现象），转移上清液至100.0 mL旋蒸瓶中，向下层液再加入10.0 mL正己烷，重复操作1 次，合并上清液至上述旋蒸瓶中。

（3）浓缩

将上述正己烷提取液旋蒸至干（如有残液，可用氮气轻吹至干），用甲醇转移并定容至5.0 mL容量瓶中，摇匀，0.22 μm滤膜过滤，滤液待进样。

1.4.2 色谱条件

（1）色谱柱

C18柱，柱长250.0 mm，内径4.6 mm，粒径5.00 μm，或具同等性能的色谱柱。

（2）锌还原柱

柱长50.0 mm，内径4.6 mm。

（3）流动相

量取甲醇900.0 mL，四氢呋喃100.0 mL，冰乙酸0.3 mL，混匀后，加入氯化锌1.5 g，无水乙酸钠0.5 g，超声溶解后，用0.22 μm有机系滤膜过滤。

（4）流速

流速为1 mL/min。

（5）检测波长

激发波长为243 nm，发射波长为430 nm。

（6）进样量

进样量为10 μL。

2 结果分析

2.1 标准曲线、检出限及样品定量重复性

根据《GB 5009.158—2016 食品安全国家标准食品中维生素K1的测定》第一法 高效液相色谱-荧光检测法的要求，测量范围应覆盖方法的最低浓度水平（定量限）和关注浓度水平，确定标准曲线浓度范围为0.121 2 μg/mL、0.242 4 μg/mL、0.484 8 μg/mL、0.727 2 μg/mL、0.969 6 μg/mL、1.212 0 μg/mL（浓度均经过分光光度计校正）测定标准曲线（规定曲线包含0点但是不强制过0点），每一点浓度测定3 次，使用3 次数据拟合得到以下线性参数，各浓度点对应的浓度和峰面积见表1。

表1 维生素K1标准溶液浓度与对应峰面积

从试验结果可见，最终得出维生素K1的拟合标准曲线的线性方程Y=4.0×106X+2.42×104（图1），此时R2=0.999 8。标准曲线线性回归方程相关系数大于0.990 0，浓度范围覆盖关注浓度的0%～150%，满足《GB/T 27417—2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南》的要求。

图1 维生素K1标准溶曲线

采用标准偏差法，选择阴性样品（即试样中本身不含有维生素K1）试样，称取10 份，每份称取1.0 g左右，按标准方法进行检测按LOD的表示方法为3 s，LOQ为3 倍的LOD（（表2）。

表2 维生素K1方法检出限与定量限结果

从试验结果可见，奶粉称样量为1.0 g，定容体积为5.0 mL时，方法检出限为0.74 μg/100 g，方法定量限为2.23 μg/100 g。低于该方法规定的检出限和定量限（称样量为1.00 g，定容体积为5.0 mL时，方法检出限为1.5 μg/100 g，方法定量限为5.00 μg/100 g）。

2.2 不同品牌贮藏期维生素K1含量变化

选取3 种品牌的婴儿配方奶粉12 个样品，在阴凉干燥处（5 ℃）、常温（20 ℃）、低温（-18 ℃）及高温（30 ℃）4 种贮藏条件下，分别贮存4 周，每周测定1 次维生素K1含量变化，结果如图3所示。

如图3所示，不同品牌在不同贮存温度下维生素K1含量有所不同，3 种品牌最初测定维生素K1含量分别为30.40 μg/100 g、29.70 μg/100 g、30.80 μg/100 g，由图所示，贮存条件在阴凉干燥处（5 ℃）、常温（20 ℃）随时间变化含量下降幅度较小，可忽略不计；低温（-18 ℃）及高温（30 ℃）随时间变化含量有所下降，表明低温和高温均会对维生素K1含量有所影响。

图2 维生素K1含量拟合结果图

图3 不同品牌贮存期维生素K1含量变化

3 讨论

维生素K1是促进血液正常凝固及骨骼生长的重要维生素，成人需求量少，但新生儿却极易缺乏维生素K1。维生素K1在婴配粉中的含量能够补充新生儿所需，为新生儿的生长发育提供了重要保障。本文主要研究结果显示，婴配粉中的维生素K1的含量在阴凉干燥环境下和常温环境下，维生素K1含量几乎没有变化。但低温和高温均会影响维生素K1的含量，主要原因可能由于低温或高温条件下引起维生素K1分解，导致其含量减少。维生素K在未来几年仍将是令人瞩目的研究领域[13～15]。