一例林麝支气管败血波氏杆菌性肺炎的诊断※

●刘玉太 金学林 赵泽明 车利锋 吴桥兴（陕西省动物研究所 陕西 西安 710032）

林麝（Moschus berzovskii）是国家Ⅰ级重点保护动物，属偶蹄目反刍亚目麝科麝属。野生林麝在我国多个山区均有分布，其中陕西秦岭地区是重要栖息地之一[1]。麝香是一种重要的中药材和香料。为了合理保护、开发和利用，陕西省大力推广林麝的人工驯养，经过数十年的探索，在林麝驯养方面取得了一系列成果，陕西省的圈养林麝数量居全国之首[2]。

疾病是驯养林麝面临的重要问题之一。林麝个体的经济价值高，疾病给林麝养殖场带来巨大经济损失。目前，圈养林麝受多种疾病危害，主要的疾病类型包括呼吸道疾病、化脓性脓肿病、寄生虫病、胃肠炎等。据调查，呼吸系统疾病导致林麝死亡的比例高达31.27%。林麝呼吸系统疾病的主要病原包括致病性大肠杆菌、铜绿假单胞菌、巴氏杆菌等[2-6]。

支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，以下简称Bb），属于革兰氏阴性需氧球杆菌，大小为（0.2～0.3）μm×（0.5～1.0）μm，有荚膜，散在或成对排列，可在多种培养基上生长。Bb可以感染多种哺乳动物，如猪、兔、雪貂、狗、猫，也可以感染人，主要表现出呼吸道症状。Bb感染猪可导致萎缩性鼻炎，常给养猪业带来重大损失[7]。Bb可以继发于其他传染性疾病，导致动物的呼吸道症状加剧，使动物死亡率升高。Bb在猪只感染方面多呈散发或地方性流行，传播广泛且呈持续性感染[8]。Bb导致野生动物感染的病例报道较少，北京动物园在死亡的袋鼠、小熊猫、节尾狐猴肺组织上分离到过Bb[9]。Lacasse等[10]报道过Bb感染导致北极熊发生支气管炎的病例。

本文通过对一例因Bb感染死亡的林麝进行病理诊断和病原学分析，详细描述了Bb感染导致林麝的临床症状和主要脏器的病理变化，并采用16s rRNA对分离到的细菌进行鉴定，旨在为林麝呼吸系统疾病的综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物来源

陕西省佛坪县某林麝养殖基地1只猝死的怀孕林麝，年龄3岁。2020年5月18日13:00死亡，死后保存在有冰袋的泡沫箱中。

1.2 病理剖解和病料采集

林麝死亡当天23:00，按照反刍动物病理剖解规范进行剖检，详细记录主要脏器病理变化。

采集肝脏、肺脏、气管病料，分别用普通营养琼脂、血平板及麦康凯琼脂培养，37 ℃培养12～24 h。菌落长出后，对不同形态的菌落进行革兰氏染色，并继续用血平板分离培养，采用16s rRNA引物对分离的菌落进行鉴定，上游引物序列为gagtttgatcmtggctcag，下游引物序列为ctahagggtatctaatcct，目的片段为750 bp[11]。同时对肺脏、肝脏做组织触片，进行吉姆萨瑞氏染色。

采集主要组织器官，包括浅表淋巴结、扁桃体、气管、肺脏、心脏、肝脏、脾脏、肾脏等，分别用4%中性多聚甲醛固定和冻存。固定组织进行石蜡包埋和HE染色，并做组织病理学观察。

2 结果与分析

2.1 临床调查及症状

该群林麝一年前曾出现过呼吸道症状，目前部分个体已临近生产。

14 d前第一例林麝出现精神萎靡，厌食，有明显喘鸣音和鼻液。1 d后死亡，鼻腔内有鲜红色液体流出。该病例年龄3岁，雌性，临近生产。

7 d前，第二例林麝出现类似症状，鼻腔有脓性白色分泌物流出。注射头孢呋辛、林可霉素，2 d后死亡。该病例年龄4岁半，雌性，临近生产。

本例为第三例，死前2 d林麝表现出喘鸣、鼻液等症状，使用拜有利治疗。

三例死亡林麝圈舍位置关系，见图1。

2.2 剖检变化

林麝死亡时，鼻腔、口腔涌出大量红色液体（图2）。尸体柔软，腹部鼓气，被毛整齐，眼结膜苍白。肛门粪便略稀软，但成形。阴门处无明显异常。

肩前、腹股沟、颌下等浅表淋巴结无明显肿大。胸腔内有暗红色液体，胸膜壁层光滑。咽喉部扁桃体无明显肿大。双侧肺脏质地柔软，切面有红色液体流出，呈暗红色，尖叶表面有淡黄色膜样物质附着（图3）。气管内有少量泡沫样红色液体，黏膜充血，有淡黄色膜样物质附着（图4）。纵隔淋巴结未见明显肿大。

心包内有淡黄色凝胶样物质。心脏质地坚实，心尖外形无明显异常，横纵比无明显异常。外观呈黄红相间条纹，右心室内有大量血凝块。二尖瓣、三尖瓣表面光滑。肝脏边缘锐利，颜色呈暗黑色，切面暗红色，质地坚实。脾脏边缘锐利，颜色呈暗黑色，质地柔软。肾脏外观无明显异常，被膜易剥离，切面皮质、髓质界限清晰。膀胱大小适中，黏膜白色，尿液清亮，未见明显异常。肠系膜淋巴结未见肿大。子宫为双角子宫，有两个雌性胎儿。消化道眼观无明显异常。由于未携带开颅工具，未做神经系统检查。

2.3 组织病理学变化

2.3.1 肺脏细支气管、肺泡腔内充满红细胞及中性粒细胞等炎性细胞，肺泡壁增厚，Ⅰ型肺泡上皮细胞水泡变性。肺泡毛细血管充血，肺泡内可见大量网状、红染的凝固纤维蛋白。肺小叶间隔增宽（图5-A和图5-B）。

2.3.2 气管黏膜结构完整，黏膜下层毛细血管充血，间质水肿，大量炎性细胞浸润（图5-C）。

2.3.3 颌下淋巴结淋巴结内毛细血管充血，被膜下水肿，大量炎性细胞浸润。皮质淋巴滤泡反应性增大。髓窦内大量泡沫样巨噬细胞（图5-D）。

2.3.4 扁桃体扁桃体隐窝内有少量渗出的炎性细胞及脱落细胞，淋巴滤泡排空，毛细血管充血（图5-E）。

2.3.5 脾脏脾脏白髓区减小，淋巴细胞减少；红髓区充血，大量含铁血黄素沉着（图5- F）。

2.3.6 心脏、肝脏、肾脏未见明显异常。

2.4 组织触片检查

肺脏、气管的触片经吉姆萨瑞氏染色后可见大量两极着染的短杆菌，如图6箭头所示。

2.5 细菌分离培养与鉴定

普通营养琼脂上仅肺脏和气管病料有菌落生长。麦康凯琼脂上未有菌落生长。普通营养琼脂上肺脏病料形成单一的光滑、湿润、白色、半透明的隆起，中等大小菌落，经革兰氏染色，可见革兰阴性、两极着染的球杆菌，记为A菌（图7-A）。

普通营养琼脂上气管病料仅有一种菌落形成，为光滑、湿润、白色、半透明的隆起，中等大小菌落，经革兰氏染色，可见革兰阴性、两极着染的球杆菌，记为B菌（图7-B），其与肺脏病料细菌形态相近。

采用16s rRNA引物鉴定纯化后的细菌，经Genbank比对，A和B分离菌均为支气管败血性波氏杆菌，与编号CP050967.1的分离株同源性为99.48%。

2.6 诊断结果

综合以上检查结果，可以判定该病例是由败血性波氏杆菌感染引起的出血性大叶性肺炎,并最终导致死亡。细菌感染主要对肺脏造成损伤，并引起脾脏、颌下淋巴结、扁桃体等免疫器官的炎性反应和损伤。根据脾脏、淋巴结、扁桃体表现出白髓区减小、淋巴滤泡排空等病理变化，表明动物机体的免疫力衰竭。脾脏出现大量含铁血黄素，表示细菌感染引起了大量红细胞的崩解。

3 结论与讨论

肺炎是圈养麝类种群面临的重要疾病之一，主要病因为受惊和环境突变等刺激性因素，动物临床表现为体温升高、呼吸浅快、脓样鼻漏、食欲减退、喘鸣[3,12]。患肺炎的个体病程发展较快，因林麝天性胆小，给药过程中的抓捕等行为可能会加重病症，感染肺炎后林麝死亡率较高。目前，在对圈养麝类动物肺炎病原的研究中，分离到的主要病原有致病性大肠杆菌、铜绿假单胞菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、支原体等。其中较多病原是致病性大肠杆菌[13]，尚未有Bb感染引起林麝肺炎的病例报道。

根据临床调查发现3头病死林麝均是妊娠雌性个体，且3个病例的圈舍临近，临床症状和病程相似。虽然没有前两例病例的病料研究，但可以推测3例病例之间具有很强的关联性。临床表现均有明显脓性和红色鼻漏、喘鸣等症状，表明可能是同一种病原引起的死亡。本病例死亡时鼻腔、口腔均有红色液体流出。剖检前，对鼻腔分泌物进行革兰氏染色镜检，未见链状排列的有荚膜的粗大杆菌。

气管和肺脏表现出明显的病理变化，胸腔有红色积液，与肺脏和气管的组织病理学变化相对应，呈现典型的出血性纤维化肺炎特征。在以往报道的林麝大肠杆菌肺炎中，肺脏表现出多处化脓灶，并在肝脏形成转移性脓肿灶[4,14]。而本病例的肺脏、颌下淋巴结、扁桃体和脾脏出现明显的病理损伤，肺脏可见大量纤维蛋白渗出和中性粒细胞浸润，呈现细菌感染的病理变化特征。同时肺泡内有大量红细胞渗出，表明肺泡毛细血管壁出现损伤。颌下淋巴结、脾脏、扁桃体等免疫器官的淋巴细胞区域表现出不同程度的淋巴细胞排空，表明林麝的免疫机能处于不断衰竭的过程[15]。此外，心脏、肝脏、肾脏等主要脏器并未表现出明显的病理变化。

组织触片染色和细菌分离纯化后染色均可见单一的两极着染的杆状细菌，革兰氏染色呈阴性。经16s rRNA PCR鉴定和Genbank比对，与支气管败血性波氏杆菌的同源性为99.48%。在以往的研究中，Bb对猪和兔造成的危害比较大，可造成猪的支气管肺炎、萎缩性鼻炎，兔主要病变也是鼻腔和肺脏，引起脓性鼻分泌物、肺脏化脓等[1,16-18]。Lacasse等[10]报道Bb可以导致北极熊发生气管炎，并且具有传染性。李伟杰等[9]采用16s rRNA方法对北京动物园死亡的野生动物肺脏、血液等样品进行分离，鉴定了数个Bb菌株，与支气管败血性波氏杆菌模式菌株存在很高的同源性，但未分析Bb菌株与这些动物死因的关系，Bb菌株在野生动物呼吸道中可能是常在细菌。当环境改变或动物机体免疫力降低时，Bb会导致动物患肺炎、气管炎等。综上，Bb感染是导致本病例发生出血性大叶性肺炎的主要原因，与以往报道的林麝肺炎病例或其他Bb所致的兔、猪的肺炎不同，该病例呈现发病急、病程短、致死率高的特征。预防Bb感染主要在于环境控制，在气候多变时应注意畜舍的保暖，减少应激因素。对于妊娠林麝应加强管理，出现发病个体时应及时隔离治疗。