鹿血水解物抗氧化能力研究※
2021-08-12韩欢胜郭喜明柴孟龙
●韩欢胜 郭喜明 徐 馨 柴孟龙
（1.哈尔滨博蒙生物科技有限公司 黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江普惠特产有限公司 黑龙江 哈尔滨 150030）
梅花鹿(Cerrus nipponTemminck) 为哺乳纲鹿科鹿属的反刍动物，是东北季风区的特产物种[1]。鹿血是鹿科动物梅花鹿或马鹿（Cerrus elaphusLinaeus）膛血或茸血，性热，味甘咸，归肝、肾经；具有养血益精、行血祛瘀、消肿疗伤等功效[2]，是我国传统的名贵中药，是上品动物中药。随着人们对大健康的重视，对药食同源保健品的认可度也越来越高，因此，梅花鹿产业及相关副产品开发利用发展迅速。
鹿血中富含蛋白质和多种氨基酸营养成分[3]，研究表明动物类药材功效的主要物质基础为由氨基酸组成的活性肽。同时，氧化应激反应是体内自由基产生的一种负面作用，是导致衰老和许多疾病发生的重要因素之一。因此，本文比较不同蛋白酶水解鹿血后其水解物的抗氧化功效，对鹿血的开发和利用具有一定的意义。
1 材料与方法
1.1 鹿血样本的采集
四只1岁龄的东北梅花鹿，雌雄各半，身形健壮，精神状态良好，均来源于吉林省长春市双阳鹿乡镇某鹿场。梅花鹿在采血前禁食12 h后开始麻醉，通过颈静脉进行采血和收集，并带回实验室进行冷冻干燥处理，粉末过筛备用 。
1.2 试验仪器
万分之一电子天平 BP211D 德国 Switzerland 公司KQ-250DB 数控超声清洗器 昆山超声波仪器有限公司DHG-9240A 恒温干燥箱 上海一恒科技有限公司Milli-Q Advantage A1 超纯水器 美国密理博公司ELX800酶标仪 美国Bio-Tek有限公司5810R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司
1.3 试验试剂
碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶均购于 Solarbio 公司， DPPH 自由基购于Sigma 公司，四硼酸钠、邻苯二甲醛、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇等试剂均为国产分析纯。
1.4 试验方法
选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶分别对鹿血进行酶解，筛选出最佳的蛋白酶种类。将预处理的冻干鹿血配制成溶液，分别与3种蛋白酶以底物浓度比为 1∶50进行混合，调节三种酶反应时最佳的温度和pH条件，并在反应中连续使用NaOH保持pH不变，记录NaOH使用量（mL）和水解度（DH）。酶水解结束后，90 ℃ 水浴下灭活5 min，连续加入HCl将水解物溶液pH调整为7.0，真空冷冻干燥鹿血水解物溶液，4 ℃保存。
将冻干的鹿血水解物溶解，配置成浓度为30 mg/mL的溶液，测定不同蛋白酶水解鹿血的水解度、DPPH 自由基的清除率和总还原力。
1.4.1 水解度（DH）根据pH-Stat法[4]，水解度的计算公式为：DH=h/htot×100%。公式中h为水解后鹿血中肽键量（mmol/g），htot为鹿血中肽键的总量（mmol/g）。其中h=B×Nb×1/α×1/Mt，公式中B为鹿血水解过程中NaOH使用量(mL)，Nb为碱液的浓度（mol/L），Mt为鹿血水解物溶液中蛋白质的量（g），1/α为校正系数。
1.4.2 DPPH自由基清除率取4mL 1×10-4mol/L DPPH和甲醇混合溶液，分别与不同酶水解产生的鹿血水解物溶液1mL，放入试管中摇匀，常温避光反应 30 min，采用分光光度计在517 nm波长下测量吸光度。DPPH自由基清除率=［1-（B1-B2）/B3］×100%。其中公式中B1为DPPH与鹿血水解物混合溶液的吸光度，B2为鹿血水解物溶液的吸光度，B3是单独DPPH 溶液的吸光度。
1.4.3 总还原力取3.0 mL FRAP （ferric reducing/antioxidant power）试剂加热到38℃后加入0.1 mL鹿鞭水解物和0.3 mL H2O，反应10 min，采用分光光度计，在593 nm 波长下进行吸光度的测定。同时，作阴性对照和阳性对照进行比较。根据绘制FeSO4·7H2O标准曲线，测定鹿血水解物吸光度表示其抗氧化活性强弱。
1.5 数据处理
用Excell软件统计分析数据。
2 结果与分析
2.1 测定不同蛋白酶作用下鹿血水解物的水解度
如图1所示，随着水解反应时间的增加，3种蛋白酶作用下鹿血水解物的水解度均增大，曲线变化明显；其中碱性蛋白酶作用下鹿血水解物的水解度变化趋势显著高于中性蛋白酶和复合蛋白酶，为最佳水解蛋白酶种类。
2.2 测定不同蛋白酶作用下鹿血水解物DPPH自由基的清除率
如图2所示，随着水解反应时间的增加，3种蛋白酶作用下鹿血水解物DPPH 自由基清除能力增强；其中碱性蛋白酶水解后的鹿血水解物比中性蛋白酶和复合蛋白酶具有更高的清除 DPPH自由基活性作用。鹿血酶水解物具有较强的自由基清除能力，可能与其富含色氨酸、亮氨酸和赖氨酸等氨基酸残基具有较强的抗氧化能力有关。
2.3 测定不同蛋白酶作用下鹿血水解物的总还原力
如图3所示，随着水解反应时间的增加，3种蛋白酶作用下鹿血的水解物总还原力增强；其中碱性蛋白酶作用下鹿血水解物的总还原能力均高于中性蛋白酶和复合蛋白酶。鹿血酶水解物具有较强的总还原能力，可能与其在酶水解时肽链发生断裂和增加氢离子数量有关。
3 结论
本文通过采用3 种不同的蛋白酶（碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶) 在最适温度和pH条件下水解鹿血，以水解度为指标筛选出最佳水解蛋白酶种类为碱性蛋白酶，并研究和比较3种鹿血水解物的抗氧化活性，结果发现，3种鹿血水解物均具有较好的抗氧化能力，随水解反应时间的增长而增加，并且碱性蛋白酶作用下鹿血水解物的DPPH自由基清除能力和总还原能力较其他两种蛋白酶略高。鹿血水解物抗氧化活性可能与蛋白质水解后分解成特殊肽和氨基酸残基成分有关，这对鹿血的进一步开发利用和抗氧化应激作用方面相关研究具有一定的参考价值和意义。
