微生物磷脂酶D的克隆表达研究进展

董自星，杨爽爽，唐存多，姚伦广，阚云超

（1.南阳师范学院昆虫生物反应器河南省工程实验室和河南省南水北调中线水源区生态安全重点实验室, 河南南阳 473061；2.南阳师范学院体育学院, 河南南阳473061）

磷脂酶是指催化磷脂的各种水解反应的一类酶。根据水解磷脂位置的不同，可以将磷脂酶分为五类：磷脂酶A1、A2、B、C和D。其中，磷脂酶D（Phospholipase D，简称PLD，EC 3.1.4.4）是作用于磷脂分子中磷酸与有机碱间磷酰氧键（P-O）的一类酶[1]。作为磷酸二酯酶超家族的一员，PLD是催化磷脂水解第一步反应的关键酶之一，参与细胞脂质代谢、信号转导及生物膜形成等[2]。此外，它还可以催化各种羟基化合物与磷脂碱基结合形成新的磷脂，这一重要的特性称为磷脂酶D的碱基交换反应（Base exchange reaction），也称为转磷脂反应（Transphosphatidylation）[3]。利用PLD的这一重要特性可以合成稀有磷脂（如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油以及新型甘油醚磷脂等）[4−6]、新型药物释放系统[7]等。因此，PLD被广泛应用于细胞生物学、食品和医药等领域。

磷脂酶D广泛分布于病毒、动物、植物和微生物中[3]。由于具有较好的转磷脂活性、较广泛的底物特异性和较强的底物耐受性，微生物来源的磷脂酶D在工业生产中的应用较为广泛。自20世纪70年代以来，已报道的PLD主要来源于革兰氏阳性菌，包括链霉菌属（Streptomyces）[8−10]、轮枝链霉菌属（Streptoverticillium）[11]、马杜拉放线菌属（Actinomadura）[12]、芽胞杆菌属（Bacillus）[13]、棒状杆菌属（Corynebacterium）[14]和 热 密 卷 菌 属（Thermocrispum）[15]等。其中，链霉菌来源的PLD是目前报道最多的，且它们具有较好的水解和转磷脂活性[1]。一些革兰氏阴性菌也具有PLD活性，如不动杆菌属（Acinetobacter）[4]、希瓦氏菌属（Shewanella）[16]、克雷伯氏菌属（Klebsiella）[17]、大肠杆菌属（Escherichia）[18,19]、沙门氏菌属（Salmonella）[20]、变形杆菌属（Proteus）[20]、假单胞菌属（Pseudomonas）[20]、苍白杆菌属（Ochrobactrum）[21]和弧菌属（Vibrio）[22]等。此外，少数酵母菌和丝状真菌也能生产PLD，包括酵母属（Saccharomyces）[23]、假丝酵母属（Candida）[24]、裂 殖 酵 母 属（Schizosaccaromyces）[25]、曲 霉 属（Aspergillus）[26]、地霉属（Geotrichum）[27]和镰刀菌属（Fusarium）[28]等。

目前，国外对微生物PLD的研究已较为成熟，一些酶制剂公司已筛选出高产PLD的链霉菌菌株。但链霉菌较长的生长周期（近7 d）给实际生产和应用带来了许多困难，而且商品化PLD的价格非常昂贵，如Sigma-Aldrich公司的Streptomycessp. PLD酶制剂，每毫克售价约一千元人民币左右。而目前国内由微生物发酵制备PLD的研究才刚刚起步，基本上都停留在实验室水平，还没有相关的PLD产品。随着应用研究的不断深入，对微生物PLD的属性特别是生物活性与生化特征多样性的需求也越来越迫切。因此，如何获得催化性能优良的PLD，并实现其大规模生产成为当前研究的核心任务。除了从自然界中筛选、诱变育种和原生质体融合等传统方法，通过分子克隆与基因重组技术将pld基因进行克隆表达，也是实现其高效表达的一条有效途径。本文先对已克隆的微生物PLD的来源、基因序列和转磷脂活性进行了比较，然后同时从分子水平和发酵水平对其高效表达方面的研究进展进行了分析，并对其未来的发展趋势进行了展望。

1 微生物磷脂酶D的克隆

获得具有优良催化特性、适合工业化应用的酶源是实现其大规模工业化生产的物质基础。目前已克隆的微生物磷脂酶D大部分来源于细菌（主要是链霉菌），少部分来源于酵母和丝状真菌，但只有细菌来源的PLD被表达（表1）。其中，细菌PLD一般由307～587个氨基酸残基组成，其单体的相对分子质量为29.0～64.0 kDa，而已克隆的酵母和真菌PLD比较大，由833～1823个氨基酸组成，其理论分子量为95.7～204.8 kDa。进化树的分析表明，已克隆表达的细菌来源PLD可以分为三类：I和III类主要来源于链霉菌属，对磷脂酰丝氨酸的转化率为4%～91.4%；而II类PLD则来源于其它细菌，它们对磷脂酰丝氨酸的转化率较高，可达到86%～100%（图1）[4,19]。其中，ArPLD没有水解活性，只有转磷脂活性，它对磷酯酰丝氨酸和二十二碳六烯酸-磷脂酰丝氨酸的转化率和选择性均为100%，这是目前已报道的唯一具有此优良催化特性的磷脂酶D[4]。此外，微生物PLD一般含有两个高度保守的、与催化活性有关的HXKX4D（X为任意氨基酸，简称HKD）基序，其中一个His是攻击磷原子的亲核基团，而另一个His是酸碱催化剂。由图2可知，I类PLD含有两个保守的HKD基序，二者之间相差247～364 aa；II类PLD也含有两个保守的HKD基序。其中，第一个HKD基序与I类PLD的第一个HKD基序是对应的，但第二个HKD不相互对应，且两个HKD基序相差123～216 aa。而III类PLD的两个HKD基序分别是HXKX3D和HXKX7D[29]，而且它们不是高度保守的，二个基序之间相差12 aa。其中，CpPLD和TsPLD不含有HKD基序，它们中可能参与催化的两个His用粗体标出[15]。

图1 进化树描述细菌来源PLDs的亲缘关系Fig.1 Phylogenetic tree describing the genetic distances among bacterial PLDs

表1 微生物来源磷脂酶D的克隆表达Table 1 Various microbial PLDs that have been cloned and expressed

续表 1

2 微生物磷脂酶D的高效表达策略

2.1 分子水平

2.1.1 表达系统的选择与优化 重组蛋白的表达调控是一个复杂的系统，构建表达系统需要特定的元件，它们的配置对蛋白的表达有着重要影响。选择合适的表达系统（包括表达宿主和表达载体）是高水平生产重组酶的第一步。其中，表达载体通常包括启动子、信号肽、密码子、核糖体结合位点、转录终止子和拷贝数等（图3）。通过对这些基因调控元件进行优化、改造并加以组合，可以提高微生物来源PLD的表达量。迄今为止，已有不少研究者对微生物来源PLD进行了克隆表达的尝试。由表1可知，目前PLD的异源表达主要是在大肠杆菌中进行的，也有少数在毕赤酵母、解脂耶氏酵母、变铅链霉菌、谷氨酸棒杆菌以及枯草芽胞杆菌中进行克隆表达的报道。

图3 微生物PLDs高效表达的相关策略Fig.3 Strategies for the high-efficiency expression of microbial PLDs

2.1.1.1 PLD在大肠杆菌中的克隆表达 由于生长迅速、培养成本低廉，大肠杆菌成为微生物PLD的主要异源表达系统。但在大肠杆菌中对PLD进行异源表达时，它们对表达宿主有明显的毒害作用[45]，或影响其细胞生长[9,13]，或引起重组质粒大量丢失[39]，这是导致其表达量较低的重要原因。因此，应该采取措施减少PLD对细胞的毒性，比如将PLD进行分泌表达或细胞表面展示。目前，在大肠杆菌中克隆表达pld基因时，所采用的质粒大多数不含信号肽，如pETDuet、pET-21a （+）、pET-23a （+）、pET-24a （+）、pET-28a （+）、pET-30b （+）以及pET-32b （+）等。因此，所表达的重组PLD均为胞内酶，且酶活较低（表1）。虽然李斌等[10]、Songer等[14]、Iwasaki等[36]以 及Xiong等[37]分 别 尝 试 采 用PelB或PLD自身信 号肽将ScPLD2、CpPLD和SaPLD2分泌到大肠杆菌细胞外，但获得的重组PLD主要分布在胞内或周质空间。而Zambonelli等[9]虽然采用PelB信号肽将SsPLD3在大肠杆菌的胞外进行了表达，但其胞外酶活只有15 mU/mL，且胞内也有积累。2017年，陈可泉等[46]进一步根据大肠杆菌的密码子偏好性将该酶进行了密码子优化，使该酶的胞外表达量提高了近20倍。此外，Zhang等[34]通过将自主转运蛋白ADIA-1的序列、信号肽CtxB的N端序列与SgPLD的序列融合后，使其在大肠杆菌的表面进行了展示，其酶活为0.39 U/mL。

选择合适的表达宿主、降低诱导温度或将PLD表达成包涵体等也是降低其对细胞毒性的重要措施。Xiong等[37]通过使用严谨型启动子PBAD、在表达质粒中插入pSC101的par区域以及大肠杆菌recA突变株等策略保持质粒的稳定遗传，同时根据大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化、补加天冬氨酸或天冬酰胺等、18 ℃饱和诱导以及施加NaCl胁迫，从而缓解了SaPLD2对宿主细胞的毒性，延长了其合成时间，使其PLD在5 L发酵罐中的酶活和比产率分别达到120 U/mL和4300 U/（L·h），是目前发酵罐上报道的最高水平。

2.1.1.2 PLD在其它表达系统中的克隆表达 近年来，研究者们也尝试采用毕赤酵母、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、变铅链霉菌和枯草芽胞杆菌等表达系统对PLD进行高效表达。为减少PLD对细胞的毒性，克隆表达主要是在胞外或细胞表面进行的。2012年，张莹[39]将ShPLD分别在毕赤酵母、解脂耶氏酵母和变铅链霉菌中进行了分泌表达，摇瓶发酵水平上，其胞外酶活分别为1.0、0.2和69.12 U/mL，其中变铅链霉菌中的PLD酶活是目前报道的摇瓶发酵水平上的最高酶活。2019年，刘逸寒等[40]进一步采用Flolp锚定信号序列将该磷脂酶D在毕赤酵母表面进行了展示，使其酶活达到315 U/g细胞干重。此外，该研究团队还将ScPLD2和S. septatusTCCC 21057来源PLD进行了密码子优化，并分别在毕赤酵母中进行了表面展示和分泌表达，其酶活分别为0.0884 U/mg和2.37 U/mL[35,41]。Matsumoto等[42]和Ogino等[11]分别将SsPLD4和ScPLD3在变铅链霉菌中进行了分泌表达，其胞外酶活分别为9.6 U/mg和55 U/mL （表达量为118 mg/L），纯化后的比酶活分别为384和468 U/mg，远高于商品化PLD的比酶活（30～150 U/mg）[21]。2009年，路福平课题组[19]将EcPLD2在枯草芽胞杆菌的胞外进行了表达，重组酶的胞外酶活为1.68 U/mL。2011年，Nakazawa等[43]利用大肠杆菌-变铅链霉菌穿梭质粒将SrPLD在变铅链霉菌中进行了分泌表达，摇瓶水平的酶活为30 U/mL，比野生菌的酶活提高了近90倍。2018年，Huang等[44]进一步将该PLD在枯草芽胞杆菌WB600的胞外进行了表达，胞外酶活为1.8 U/mL；再通过对信号肽、表达载体、核糖体结合位点以及spacer区进行优化，使其摇瓶中胞外酶活提高了约12.4倍，达到24.2 U/mL，15 L发酵罐中的酶活达到116.2 U/mL。

综上所述，PLD对宿主细胞有一定的毒害作用，应采用分泌表达、细胞表面展示等方法减少其毒性。而目前微生物来源PLD的异源表达主要是在大肠杆菌的胞内进行的，所获得的重组酶容易形成包涵体，且活性较低，后期分离纯化较为困难，难以进一步实现其高水平表达。与大肠杆菌相比，PLD在枯草芽胞杆菌、毕赤酵母、解脂耶氏酵母、变铅链霉菌中的表达量较高，而且更容易实现分泌表达或表面展示。因此，使用这些表达系统可能更有利于实现PLD的高效表达。此外，目前的研究只集中于对一种或几种表达元件进行优化，这也很难提高PLD的表达量，应该将它们进行改造、优化并加以组合。

2.1.2 分子改造 微生物PLD中含有两个保守HKD活性基序，这两个保守序列是酶活性中心，任意氨基酸的改变都会影响PLD的催化活性。因此，通过对这些关键氨基酸残基进行定点突变，可以提高其催化效率和比酶活，从而可以间接提高其表达量。徐银凤等[47]发现BcPLD只含有一个HKD保守序列，而另外一个是HRD（图2）。通过定点突变将HRD突变为HKD后，使其酶活提高了10%左右。另外，Fedeli等[45]将SsPLD3中两个高度保守的HKD基序中的His167、His440、Lys169和Lys442分别进行定点突变后，其表达量显著提高，而且突变体的空间结构没有明显改变，但它们完全失活。Yang等[30]的研究也表明，将ScPLD1中保守HKD基序的His187和His200突变为Ala后，其二级结构发生改变且酶活显著下降；但若将其突变为Asn，突变体的酶活和结构则没有明显变化。Ogino等[48]证明了ScPLD3中两个HKD基序中的GG和GS基序（特别是丝氨酸残基，图2）会影响酶的转磷脂活性和稳定性，其中突变体G215S、G216S和G216S/S489G的转磷脂活性是野生酶的9～27倍。此外，通过定向进化也可以提高PLD的表达量。Zhang等[34]采用DNA shuffling将大肠杆菌表面展示的SgPLD进行改造后，使其酶活提高了约90%，达到0.074 U/mL。

2.2 发酵水平

2.2.1 培养基成分优化 培养基中的氮源、氮源以及表面活性剂等会影响PLD的表达量（图3）。大量研究表明，葡萄糖和蛋白胨分别是PLD生产的最佳碳源和氮源。如Chiaki等[11]研究发现，在2 L发酵罐中对重组变铅链霉菌进行发酵，当起始葡萄糖浓度为17.5 g/L，且同时补加葡萄糖和胰蛋白胨时，重组酶ScPLD3的酶活和表达量分别从20 U/mL和42 mg/L提高到55 U/mL和118 mg/L。进一步将该重组菌进行固定化，且同时在起始培养基中添加葡萄糖和胰蛋白胨时，重组酶的胞外表达量提高了1倍[49]。表面活性剂可以提高细胞膜的通透性，从而可以提高蛋白质的胞外表达量。Yang等[18]研究了不同的表面活性剂对EcPLD1表达量的影响，其中0.4%曲拉通X-100可以使其胞外酶活从3.2 U/mL提高到13.5 U/mL。此外，曲拉通X-100也对SsPLD4的水解活性有显著影响[42]。而韩海霞等[50]则发现30 g/L吐温20可以使链霉菌CA-1的PLD活性提高了4.5倍，达到1.198 U/mL。

2.2.2 发酵条件优化 研究表明，发酵条件也是影响PLD表达量的重要因素之一。所用的发酵菌株和发酵设备不同，则其PLD发酵条件也不同，应该通过优化进行确定。刘逸寒等[51]通过单因素实验对细胞表面展示表达PLD的重组毕赤酵母菌株GS115/pKFS-pld的摇瓶发酵培养条件（包括诱导温度、起始pH、甲醇浓度、装液量及转速等）进行了优化，使其酶活提高了44%。进一步对5 L发酵罐的分批补料培养条件（包括甘油流加速度、甲醇流加模式）进行优化后，使其产酶水平比摇瓶提高了53%。Iwasaki等[36]研究了培养基、诱导温度和诱导OD600nm对重组大肠杆菌表达SaPLD2的影响，在最佳培养条件下重组酶的酶活比原来提高了18.3倍，达到了3.47 U/mL。

2.2.3 固定化 固定化细胞发酵产酶可以提高产酶效率、发酵稳定性好、缩短发酵周期和提高设备利用率。Ogino等[49]利用生物质载体颗粒对重组变铅链霉菌进行固定化，使其能连续8个批次稳定生产PLD，2个批次后其发酵周期从48 h降低到24 h，酶活提高了8倍多，达到15 U/mL。Fukuda等[52]采用多孔颗粒将S.cinnamoneumNBRC12852固定化后，将其进行连续分批发酵，磷脂酶D的生产效率达到57.9 IU/（L·h），比原来提高了1倍多。

3 结语

目前克隆表达的主要是链霉菌PLD，它们对磷脂酰丝氨酸的转化率偏低。随着分子生物学技术的发展，以ArPLD为探针，采用基因组挖矿或宏基因组技术可以获得催化性能更优异、更适合工业化应用的II类PLD酶源，为其大规模生产提供良好的物质材料。目前PLD的异源表达主要是在大肠杆菌中进行的，但PLD对细胞的毒性限制了其表达。可以尝试其它表达系统，还可以构建新的表达系统或多个磷脂酶D基因共表达系统，进而实现其高效制备。此外，目前的研究中只采取了一种或少数几种高效表达策略，在提高PLD的表达量方面效果有限。后续研究应同时使用更多策略，如：综合运用表达元件的分子改造与组合、PLD的分子改造、发酵工艺优化以及固定化等技术，同时从分子水平和发酵水平上实现微生物PLD的高丰度表达；同时运用单因素实验、响应面优化以及遗传算法等实验设计技术进一步从发酵水平上提高PLD的表达量。随着研究的不断深入，相信我国微生物PLD的高效制备与工业应用研究必将进入一个新的历史阶段。