平菇培养料诱导处理初探*

李 娟，解文强，苑国民，周廷斌，彭学文

（唐山市农业科学研究院，河北 唐山 063000）

平菇（Pleurotus ostreatus）培养料类型主要有生料、发酵料、熟料3种[1-3]，3种类型各有优缺点。随着近年来市场竞争加剧，错季（高温季节）出菇越来越多，由于气温较高，环境杂菌基数大，发酵料或生料栽培菌袋污染率较高，因此常采用熟料栽培。过去平菇栽培户通常采用成本较低的燃煤锅炉灭菌，但随着环境污染治理力度的持续加强，这种方式在多个省份被禁用，对微利的平菇行业来说无疑是雪上加霜。诱导灭菌是将培养料中的真菌孢子、细菌芽孢等休眠体诱导萌发成营养体，然后再进行高温灭杀的一种灭菌方法[4]。此方法既具有熟料灭菌的优势，且灭菌成本低，是近年来行业内逐渐采用的培养料处理方法。但培养料在诱导过程中pH、温度、微生物种群变化以及灭菌效果等方面尚缺乏基本数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验原料

玉米芯、棉籽皮、麸皮、土豆、生石灰等均采购自市场；琼脂购自石狮市环球琼胶工业有限公司。

1.2 试验配方

微生物培养、灭菌效果检验培养基为LB培养基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 5 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.4；平菇培养料配方：玉米芯46.5%、棉籽壳46.5%、麸皮5%、生石灰2%，料水比 1∶1.4。

1.3 试验仪器

pH计，杭州齐威仪器有限公司；DIJITAL S菌落计数仪，西班牙J.P.SELECTA公司；HH-420水浴锅，上海力辰邦西仪器科技有限公司；LCD-280S温度计，常州市瑞明仪表厂；OSE-VX-01振荡器，天根生化科技（北京）有限公司；移液器，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；诱导装置为钢筋混凝土浇筑，外覆保温层，下置通风管道，外置离心空压机、温控仪等设备，可控制温度。

1.4 诱导方法

原料按配方称量、混合均匀后，置于诱导装置内，每2小时通气10 min，诱导40 h。

1.5 细菌、真菌计数方法

平皿计数法。于诱导装置内随机3点取样，分别称取原料样品10 g于90 mL无菌水中，充分震荡10 min，后吸取1 mL于9 mL无菌水中，充分震荡5 min，稀释至 10-9g·mL-1，选取 10-7g·mL-1、10-8g·mL-1、10-9g·mL-1（取样时间不同，稀释倍数略有调整）分别吸取0.1 mL涂布平皿，每个浓度3次重复，于26℃培养，统计菌落数。在诱导过程中每4小时取样1次。

1.6 温度、pH测定方法

将温度计探头预先埋入料堆内，上下两层布置。下层探头距料堆底部20 cm，上层探头距离底部40 cm。在诱导过程中每2小时记录1次。

pH测量，上述1.5取样后，称取样品10 g加入50 mL蒸馏水中，充分震荡30 min，过滤后使用pH计测量滤液，在诱导过程中每4小时测量1次。

1.7 灭菌方法

依上述1.5取样涂布平皿后，将剩余各样品置于95℃水浴锅中5 min，冷却后吸取0.1 mL涂布平皿，每浓度3次重复，于26℃培养，统计菌落数。

诱导结束后的培养料摊凉、装袋，100℃灭菌2 h，冷却至30℃以下时接种平菇菌种。灭菌结束后培养料亦取样计菌落数，方法同1.5。

2 结果与分析

2.1 温度和pH变化情况

不同取样时间原料诱导后原料的温度和pH变化见图1。

图1 温度、pH变化曲线图Fig.1 The transformation of temperature and pH

由图1所示，拌料后4 h（第2次取样），温度快速上升3.5℃，pH随之下降，下降幅度较小，仅下降了0.06。随后的16 h，即至第6次取样，温度快速上升，累计升温16.8℃，每小时上升1.05℃。这一时期也是pH快速下降的时期，由6.92下降至6.39，共下降了0.53，每小时下降0.03。由此直至诱导结束合计20 h内，温度缓慢上升，总计上升3.9℃，每小时仅上升0.11℃，为第2阶段的约1/10；pH先升后降，第9次取样时pH明显升高，8 h后达到整个诱导期的最低值6.07，直到诱导结束装袋灭菌后再次测量，pH重新回升至6.48。

2.2 微生物数量变化情况

诱导过程中，微生物数量统计见表1。

表1 微生物数量记录表Tab.1 The number of microorganisms

由表1可知，拌料开始至第3次取样，耗时8 h左右，温度显著上升，从23.4℃上升到38.3℃，升温9.9℃，pH下降0.19，细菌总数上升明显，比拌料时增加了约5倍，达到3.900×1012个/g。灭菌后，细菌总数明显下降，为2×108个/g。此时的细菌应为营养体和休眠体的混合物，休眠体可能包含尚未萌发的及萌发后再次生成。同一时期，真菌总数下降明显，由最初的2.000×1012个/g减少为0.330×1012个/g，减少了约6倍。灭菌后总数维持在1×108个/g左右，休眠体萌发为营养体后被杀灭较多。

第4次至第7次取样耗时14 h，此期间温度为38℃～45℃，上升了6℃，pH持续下降，下降幅度0.22，达到整体诱导期的次最低值6.39，较初始pH下降了0.59。此间细菌总数急剧上升，灭菌前细菌总数未测出，灭菌后的细菌总数与灭菌前相差较少，说明大部分细菌为营养体。真菌总数继续下降，直到第7次取样不可测出。

第8次至第11次取样耗时12 h，温度持续上升，但上升速度减缓，只上升了2.2℃；pH则经历了先上升后急速下降的过程，第9次快速上升至6.86（接近初始值），至诱导结束又快速下降至整个诱导期的最低值6.07。细菌总数则持续攀升，尤其灭菌后的细菌数量大量增加，最高达2.88×1010个/g。温度的升高、pH的下降，导致细菌大量产生休眠体，在95℃处理5 min的条件下显然不能达到灭菌效果。但真菌数量则持续下降，灭菌后未测出。

综上试验结果及真菌孢子、细菌芽孢的萌发条件可知，温度在23℃～38℃，真菌孢子及细菌芽孢可大量萌发生长；随着温度的升高（达到45℃时），细菌仍能大量繁殖，真菌则不再生长；温度持续升高，细菌产生芽孢，进入休眠状态。无论是大量繁殖还是进入休眠状态都不是理想状态，所以诱导时温度是关键因素。结合本文试验结果，诱导温度宜控制在23℃～38℃。

2.3 灭菌结果

按照 ISO7218∶2007（E）[5]或国标 GB 4789.3-2016菌落计数法计算[6]，样品中均含有真菌或细菌，但总体数量均较低，统计结果见表2。

表2 100℃灭菌2 h不同稀释倍数下菌落数统计Tab.2 Statistics of colony under different dilution times after sterilization by 100℃for 2 h

由表2可知，平菇培养料经过诱导后，真菌数量明显下降，灭活后连续6批未能检出；诱导过程中细菌数量大幅度增加，但经过100℃灭菌2 h后，仅有极微量的细菌存活。通过后续的接种、培养平菇菌种后，对平菇菌丝的生长无影响。

3 结论与讨论

平菇培养料经过诱导处理后，pH经历了下降、升高、下降的变化过程，温度先期上升幅度较大，后期启动诱导装置制冷设备，阻止了温度持续上升，上升幅度亦趋缓；真菌数量急剧下降（诱导至28 h时不可检出），细菌总数持续大幅增加，最高达2.88×1010个/g。经过100℃灭菌2 h后，pH升高，细菌、真菌等杀灭效果较好，接种后对平菇菌丝的生长未有影响。

3.1 诱导时间

季节不同、外界温度不同，诱导的起始温度亦有差别。试验中起始温度为23.4℃，至诱导结束总计40 h。诱导20 h时，细菌数量急剧增加[7-8]，此时真菌总数却大幅下降，甚至不可检出，pH也明显下降；此时期培养料状态与诱导结束时的情况类似，诱导是否完全还有待于进一步试验验证。

3.2 pH变化

整个诱导期间pH出现了下降、升高、下降的变化过程，第1次下降是由于细菌的大量繁殖，产生了大量的酸类物质[9]，随着时间的延长pH出现了上升的现象，可能是前期大量的酸类物质被利用。从平皿观察，pH上升前后菌落形态统计未有显著区别。诱导过程中所产生的酸类物质并未对平菇菌丝生长产生明显的副作用，这与长期以来“拌料后尽快装袋，避免产酸”观点相悖，培养料发酵产酸导致pH下降对其菌丝生长没有影响。

3.3 真菌变化

随着诱导的进行真菌数量逐步减少，这与常路路[10]结论一致，但是究竟是减少（或失活）还是由于计数方法限制未能检出还需要进一步试验。诱导过程中细菌数量的急剧增加以及胞外分泌物的大量累积可能抑制了真菌孢子的萌发，或抑制了真菌菌丝片段的生长，导致在平板计数中未出现可见真菌菌落。此次试验中放线菌未列为观察对象，细菌种类也未进行详细鉴别，后续试验应引入高通量或从分子生物学水平加强试验手段[11-14]，提高试验结果可靠性、准确性。

由于平菇具有较广泛的适应性，生产中采用的培养料众多，除棉籽壳、玉米芯外，棉杆、蔗糖渣、豆秸、木屑等[15-18]均用于栽培平菇。采用诱导法处理培养料还需根据季节、原料（基础微生物不同）通风（进风）温度等的不同灵活掌握诱导时间。本次试验中棉籽皮、玉米芯混合培养料，混合培养料初始温度23℃，诱导40 h后，100℃灭菌2 h可用于平菇栽培。