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稀释涂布平板法计数活菌的方法简介

2018-08-07龚军辉

生物学教学 2018年2期
关键词:活菌差值菌落

龚军辉 王 晶

(河北省保定市第一中学 071000)

1 问题的提出

“微生物数量的测定”是2017年高考考纲中新增加的内容,同时也是教学的重难点。稀释涂布平板法是对微生物计数的常用方法,用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约有多少活菌。但对菌落计数的结果处理往往成为学生的易错点。

经典例题:在从土壤中分离产脲酶细菌的实验中,将10g土壤样液梯度稀释,在3个培养基平板上均接种稀释倍数为105的土壤样液0.1mL,培养一段时间后,平板上长出的细菌菌落数分别为42、200、256。则1g土壤样品中的细菌数量为________个。

很多学生得出的答案为:1.66×108。同时,学生对于42这个数据如何处理存在疑问:是否需要舍弃?如果需要舍弃,标准是什么?

2 菌落计数的基本原则

2.1 教材中的相关表述 在人教版高中生物学选修1《生物技术实践》中,对于稀释涂布平板法计数菌落有如此的表述:为了保证结果准确,一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。但是,若想当然地认为42、200、256三个数据均处于30~300范围之内,然后直接求平均值,再乘以稀释倍数,就会得出1.66×108的错误结果。这也是很多学生产生错误的原因。

事实上,教材中的相关表述只是在说明可计数的菌落数量的适宜范围。某一稀释度下的3个平板中菌落数并不能简单地直接求平均值,还应该关注稀释度的设置以及计数结果的允许差。

2.2 稀释度的设置及计数原则 为了确保有效活菌数的准确测定,在采用平板计数检测中,必须设3个稀释度且成梯度,每个梯度设3个重复[1]。测定土壤中细菌的数量,一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养;测定放线菌的数量,一般选用103、104和105倍稀释;测定真菌的数量,一般选用102、103和104倍稀释。

如果平板中菌落的数量太少,必然会导致计数误差太大;反之,如果平板中菌落数量过多,会造成计数上的困难。因此,国际上通用的菌落计数的基本原则,是以平板上出现30~300个菌落数的稀释平板为计数标准。同时要求,同一个稀释度重复3次的平板上菌落数标准差值应小于允许差值[2]。也就是说,在平板计数检测中,如果同一稀释度下的3次重复菌落数虽然均处于30~300个范围之内,但数据相差较大,就需要舍弃。

2.3 同一稀释度下3个重复的允许差值 标准差的计算公式如下:

平板菌落数的允许差值如表1[3]。

表1 平板菌落数允许差值

由表1可知,如果平板上3次重复的菌落平均数较小,其允许的误差就小;反之,如果菌落平均数较大,则其允许的误差就大一些。若选一个适宜稀释度计数,则3个重复的标准差值应小于规定的允许差值。若3个重复的标准差值大于规定的允许差值,则无法正确计数,必须重新测定。

2.4 对例题的进一步分析 根据标准差公式,对上述例题计算如下:

参照表1中菌落数的允许差值可以看出,平板菌落平均数166处于101~300之内,标准所允许差值为±≤50。但经计算得知,该稀释度下3个平板菌落数的标准差值±111已远超允许差值。因此,本次的计数结果不符合要求,无法正确计数,需要重做。

3 拓展

为更好地理解和熟练掌握微生物平板菌落计数的数据处理方法,提供3组示例(表2)以供参考和借鉴。

表2 平板菌落计数的数据处理示例

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