TTC在菌落总数检测中的应用探讨

菌落总数反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品进行适当的卫生学评价，因而菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣[1]。然而在实际实验过程中，被检样品如绿豆糕等在灭菌生理盐水中并不能完全溶解，导致在培养基中出现与菌落形态相似的样品颗粒，使菌落计数增加了难度。这对于实验新人或者经验不够的实验人员来说，很容易错把样品颗粒当作菌落进行计数，造成实验结果的不准确。但通过查阅资料发现，可以在培养基中添加2,3,5-三苯基氯化四氮唑（又称TTC）溶液，以区分平板上生长的菌落与样品颗粒[2]。《化妆品安全技术规范》中添加的TTC浓度为5.0 mg/100 mL，但有相关学者研究认为TTC浓度在2.0 mg/100 mL时为最佳[3]。现将该方法引用至食品检测中，然后选取TTC浓度在0～5 mg/100 mL，探讨TTC在菌落总数检测中的适宜浓度。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

绿豆糕：超市自购；大肠埃希氏菌：ATCC25922；鼠伤寒沙门氏菌：ATCC14028；金黄色葡萄球菌：ATCC6538；蜡样芽孢杆菌：ATCC11778；单核细胞增生李斯特氏菌：ATCC19115。

1.2 培养基与试剂

氯化钠（广东光华）；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（上海麦克林）；PCA培养基（陆桥）。

1.3 仪器与设备

高压灭菌锅：YXQ-100A（上海博讯）；电子天平：BP-622B-X（上海奔普）；均质器：LC-08（宁波立诚）；培养箱：GHP-9160N型（上海一恒）；生物安全柜：BSC-1100ⅡA2-X（济南鑫贝西）；立式冷冻柜：BD-330WEPTU1（青岛海尔）。

1.4 实验方法

1.4.1 菌液制备

从4 ℃冰箱中取出大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌的工作菌株，先挑取斜面菌苔于生理盐水管中做成0.5麦氏浊度的菌悬液，然后按照10倍系列稀释法，使菌悬液浓度在104～105CFU·mL-1。

1.4.2 TTC溶液制备

取1 g TTC粉末溶于100 mL蒸馏水中，配制成1%TTC溶液，于121 ℃高压灭菌15 min后冷藏备用。

1.4.3 实验步骤

选择灭菌后的绿豆糕作为样品基质，取25 g样品加入到225 mL灭菌生理盐水中，共制备6份。取一份样品不添加任何菌液，作为样品空白对照，观察有无菌落生长。剩余5份样品分别加入大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌的菌悬液各1 mL。按照10倍系列稀释法，对以上5份添加了菌悬液的样品进行稀释。每个样品各做10组，并编号X0为对照组，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和 X9为实验组。

分别将0 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL和0.50 mL配制好的1%TTC溶液加入到冷却至46 ℃的100 mL PCA琼脂培养基中，然后倾注到 X0、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9等样品平皿中并混合均匀。待琼脂凝固后，将平板倒置，36 ℃培养48 h，观察菌落结果并计数[4]。

2 结果与分析

2.1 TTC对大肠埃希氏菌计数的影响

由表1可知，与不添加TTC溶液的对照组相比，添加TTC溶液的实验组随着TTC浓度的增加，菌落颜色逐渐加深，菌落数无明显差异（以lg差绝对值表示）[5-6]。

表1 TTC对大肠埃希氏菌计数的影响表

2.2 TTC对鼠伤寒沙门氏菌计数的影响

由表2可知，与不添加TTC溶液的对照组相比，添加TTC溶液的实验组随着TTC浓度的增加，菌落颜色逐渐加深，菌落数无明显差异。

表2 TTC对鼠伤寒沙门氏菌计数的影响表

2.3 TTC对金黄色葡萄球菌计数的影响

由表3可知，与不添加TTC溶液的对照组相比，随着TTC浓度的增加，菌落颜色逐渐加深，但是TTC浓度≥3.5 mg/100 mL时，菌落数较对照组有明显差异，且TTC浓度为5.0 mg/100 mL时，菌落不生长。

表3 TTC对金黄色葡萄球菌计数的影响表

2.4 TTC对蜡样芽孢杆菌计数的影响

由表4可知，与不添加TTC溶液的对照组相比，随着TTC浓度的增加，菌落颜色逐渐加深，菌落数无明显差异，但TTC浓度≥4.0 mg/100 mL时，菌落不生长。

表4 TTC对蜡样芽孢杆菌计数的影响表

2.5 TTC对单核细胞增生李斯特氏菌计数的影响

由表5可知，与不添加TTC溶液的对照组相比，随着TTC浓度的增加，菌落颜色逐渐加深，菌落生长不受影响。

表5 TTC对单核细胞增生李斯特氏菌计数的影响表

3 结论与讨论

TTC是一种氧化还原指示剂，溶于水中形成无色溶液[7-8]。如果添加TTC的培养基中有细菌存在，细菌在代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶可将无色的TTC还原为红色的三苯甲臢，使菌落变成红色[3]。

①在大肠埃希实验中，TTC浓度为0.5 mg/100 mL时，菌落数与对照组无明显差异，显浅粉色；TTC浓度在1.0～5.0 mg/100 mL时，菌落数与对照组无差异，菌落颜色由浅紫色到深紫色。②在鼠伤寒沙门氏菌实验中，TTC浓度为0.5～1.0 mg/100 mL时，菌落数与对照组无明显差异，菌落颜色显浅粉色；TTC浓度为1.5～5.0 mg/100 mL时，菌落数与对照组无差异，菌落颜色由浅紫色到深紫色。③在金黄色葡萄球菌实验中，TTC浓度为0.5～1.0 mg/100 mL时，菌落数与对照组无明显差异，菌落颜色显浅粉色；TTC浓度在1.5～3.0 mg/100 mL时，菌落数与对照组无差异，菌落颜色由浅紫色到深紫色；TTC浓度在3.5～4.0 mg/100 mL时，菌落颜色呈深紫色，但菌落数与对照组有明显差异；TTC浓度为5.0 mg/100 mL时，菌落不生长。④在蜡样芽孢杆菌实验中，TTC浓度为0.5～3.5 mg/100 mL时，菌落数与对照组无差异，菌落颜色由浅粉色到紫色；TTC浓度为4.0～5.0 mg/100 mL时，菌落不生长。⑤在单核细胞增生李斯特氏菌实验中，TTC浓度为0.5～1.5 mg/100 mL时，菌落数与对照组无明显差异，菌落颜色为浅粉色；在2.0～5.0 mg/100 mL时，菌落数与对照组无差异，菌落颜色由浅紫色到深紫色。

综上所述，当TTC浓度在2.0～3.5 mg/100 mL时，可以既不影响菌落生长，又能使菌落显色。

实验中所选取的大肠埃希氏菌和鼠伤寒沙门氏菌均为革兰氏阴性菌株，实验发现TTC的添加对它们的生长影响不大；金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌、蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌为革兰氏阳性杆菌，实验发现TTC的添加对单核细胞增生李斯特氏菌的生长影响不大，但对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的生长影响很大。所以，TTC浓度对球菌和芽孢菌的生长影响关系还待进一步的实验验证。