杨树口蘑菌种分离和驯化*

孟庆国，池景良，朱巍巍

（辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000）

杨树口蘑（Tricholoma populinum J.Lange） 也称地抠、老头扣、地拱子，是口蘑属（Tricholoma）中一种野生食用菌，生长于杨树（Populus L.）林。其子实体较大，菌盖直径4 cm～15 cm，扁半球形至平展，边缘内卷波状，粘，浅红褐色，趋向边缘色浅，气味香，主要分布于中国内蒙古、河北、山西、黑龙江等[1]。其味道鲜美，营养丰富，香味浓郁，肉质滑嫩，深受消费者喜爱，一直是国内热销的野生食用菌产品之一，目前没有人工驯化成功的报道。近年来由于人们过度采收，生态环境遭到破坏，自然生长的杨树口蘑产量逐年降低。因此，保护野生杨口蘑资源以及进行杨树口蘑的人工驯化栽培已经迫在眉睫。杨树口蘑市场价格鲜菇20元/kg，价格和野生红菇相当，一旦栽培成功，市场前景广阔。通过介绍杨树口蘑的菌种分离和驯化技术，以期为实现杨树口蘑的大规模人工栽培奠定基础。

1 杨树口蘑采集

秋季8月～10月雨后，在辽宁省朝阳县、内蒙古自治区敖汉等地杨树林中采集到野生杨树口蘑，见图1（图片由赵英同提供）。

如图1所示，杨树口蘑丛生，因此当发现一个子实体后就能够判断附近还有多个子实体存在，与其相邻的地方有时候也有。这种生长现象被称为“蘑菇盘”，今年采摘后，第2年在相同的方依旧会有子实体生长。

图1 杨树林与杨树口蘑Fig.1 Populus L.forest and Tricholoma populinum

2 菌种分离与纯化

2.1 培养基

PDA杨树叶培养基：马铃薯200 g、杨树叶100 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g～20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g、水1 000 mL。将土豆、杨树叶用小火煮沸30 min，然后用6层纱布过滤。加入其他成分继续加热并搅拌至全部溶化后，停止加热，补足水分。将培养基装入500 mL三角瓶中，每瓶装200 mL，115℃灭菌30 min后，在无菌条件下将培养基倒入平皿中（每个平皿约20 mL），冷却备用。

2.2 组织分离

从采集的杨树口蘑子实体样品中，选择长势好、菇形完整、中等偏大、肉厚、孢子未弹射、无病虫害的子实体，在无菌环境进行组织分离，见图2。

图2 杨树口蘑子实体组织分离Fig.2 Isolation of fruiting body tissue of Tricholoma populinum

如图2所示，子实体表面用75%酒精棉球擦拭消毒，然后放在灭好菌的平皿中。用手术刀切开子实体，在菌盖或菌柄内侧用无菌手术刀或尖嘴镊子取1 cm见方组织块接于培养皿的培养基上，然后用封口膜封口。

由于杨树口蘑的菌种分离难度较大，在组织分离过程中，一定要选好目标子实体。有虫害、含水量过高、老化的菇体都不应选用，否则组织分离很难成功。最好选用菇体未开伞的幼菇，生命力强不易感染杂菌。

2.3 培养

将培养皿放入温箱22℃恒温培养，5d～7d后组织块萌发。待菌落长到约2cm，用接种针选取最优菌落的尖端菌丝接入新培养基上，进行尖端脱毒，见图3。

图3 断桥法纯化Fig.3 Bridge breaking purification

如图3所示，在无菌条件下，采用断桥脱毒法用接种针把平皿培养基中间培养基断开1 cm，把菌种接在断开培养基一侧，菌丝穿越断开处，伸入前端的培养基上，可以纯化菌种。将纯化的杨树口蘑菌种转接到试管斜面培养基上，放入22℃恒温箱内继续培养，12 d～15 d后得到杨树口蘑纯化菌种。

在培养基的选择上除采用PDA杨树叶培养基外，还可采用杨树叶培养基（杨树叶80%、麸皮18%、糖1%、石膏1%），见图4。

图4 杨树叶培养基接种Fig.4 Poplar leaf culture medium inoculation

如图4所示，具体方法是将组织块接入瓶中杨树叶培养基中或平皿中杨树叶培养基中，采用这种方法组织块也可萌发生长。

2.4 菌丝微观形态观察

插片培养法是实验室观察真菌形态的一种基本方法。用干净的镊子，将无菌的盖玻片以45°的角度斜插入培养基中，插片位置与接种块之间距离一般为1.0 cm～1.5 cm，见图5。

图5 插片法Fig.5 Insertion method

如图5所示，待菌丝铺展开来，长过插片的位置后，即可取出玻片进行观察，见图6。

图6 杨树口蘑菌丝Fig.6 Hyphae of Tricholoma populinum

如图6所示，菌丝粗壮、丰满、均匀，并具有锁状联合。

3 液体菌种的制作

3.1 培养基配方

马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氢钾2.0 g、硫酸镁1.0 g、维生素B11片，pH 6.8～7.0，水 1 000 mL。

3.2 培养基制作

将土豆用小火煮沸30 min（标准为熟而不烂），然后用6层纱布过滤，将滤液倒入锅内，同时加入按配方称好的各种成分，继续加热并搅拌至全部溶化后，停止加热，补足水分。将培养液分装入三角瓶中，500 mL锥形瓶内装150 mL培养液，每瓶加10个玻璃珠，然后用12层纱布外加一层牛皮纸封口。

将三角瓶放入灭菌锅，上面盖上报纸，排气后，待温度升至121℃开始计时，维持30 min。降压排气后，打开锅盖冷却到30℃以下时取出三角瓶放在超净工作台中冷却。

3.3 接种与培养

选取新培养好的试管斜面菌种1支，在无菌条件下每瓶液体培养基接入2 cm2～3 cm2的母种1块，每支母种可接5个摇瓶。接种好的菌种瓶可置于摇床上培养，也可置于22℃恒温下静置培养出48 h后，在确保无杂菌且气生菌丝延伸到培养液中时再放在摇床上进行培养。摇床频率为180 r·min-1，培养温度22℃，一般培养7 d～8 d，见图7。

图7 杨树口蘑液体菌种Fig.7 Liquid strain of Tricheloma popalnum

如图7所示，a为培养中的液体菌种，b为结束培养的液体菌种。当菌丝球均匀地布满透明的橙黄色营养液中时停止培养。

4 栽培袋制作与接种

4.1 栽培袋配方

配方1：杨树木屑78%、麸皮20%、糖1%、石膏 1%，pH 6.5～7.0，含水量 60%～65%。

配方2：杨树叶78%、麸皮20%、糖1%、石膏1%，pH 6.5～7.0，含水量60%～65%。

4.2 装袋、灭菌

选17 cm×33 cm×0.005 cm聚丙烯塑料袋，装袋后袋中间用直径2 cm木棍打孔到袋底，然后加双套环。采用高压灭菌126℃持续1 h。

4.3 接菌与培养。

在无菌条件下，每个栽培袋接入液体菌种50 mL，放入培养室，22℃条件下弱光培养。接种后菌丝生长过程见图8。

如图8所示，当基质内布满菌丝，菌丝具有杨树菇特有的香味，即可结束培养。在培养过程中，配方1由于杨树木屑透气性差，菌丝生长较慢，而配方2透气好，菌丝生长速度快。一般情况下杨树木屑培养基长满需要35 d～40 d，杨树叶培养基25 d～30 d即可长满。为提高栽培袋中菌丝生长速度，也可采用窝口方式制作栽培袋，见图9。

图8 栽培袋菌丝生长过程Fig.8 Mycelial growth process of cultivation bag

图9 窝口法制作栽培袋Fig.9 Making cultivation bags by nest-mouth method

如图9所示，具体方式为装制菌包时，装袋机在菌包袋的中间留孔，将菌包培养料上面的塑料袋塞入菌包中间的孔中，然后将周转棒插入中间的孔中，倒置于筐中准备灭菌。这种方式可以使液体菌种直接接入袋内，菌丝从菌袋中部萌发并向四周辐射生长，可以缩短菌袋培养周期。

5 室内覆土栽培

将培养好的菌袋脱袋后，放入菌种筐内，并将菌种脱袋、装筐、压实、覆土，详见图10。

图10 覆土过程Fig.10 Process of soil covering

如图10所示，为了增加透气性，菌种筐底部放2层报纸或遮阳网。采用杨树林的土为覆土原料，暴晒2 d后，加入稻壳5%、石灰2%、过磷酸钙1%，并喷水使土含水量达到20%（即手握成团、落地即散、手掰土粒不见白为好）。将调好水的土壤均匀地撒在料面上，覆土厚度为3 cm，进行出菇管理。使温室保持在20℃，空气相对湿度保持在60%～70%，保持室内空气新鲜。菌丝生长情况见图11。

图11 菌丝长出土面Fig.11 The hyphae grow out of the earth

如图11所示，菌丝5 d～7 d可长出土层表面，为了保持料面湿度，在土层表面覆盖一层杨树叶，保湿效果较好。之后进行催菇管理，加大温差，使温度保持在15℃～22℃，早晚温差达到7℃～8℃，湿度保持在80%～90%，菌丝生长情况见图12。

如图12所示，一般菌丝长至土层表面后10 d～15 d可见菌丝扭结、变粗，约20 d～25 d菌丝扭结形成子实体原基形状。

图12 出菇管理过程中菌丝生长情况Fig.12 Mycelium growth during fruiting management

6 杨树林返生栽培试验

选择地形平整、正在生长的杨树林，于8月初在杨树根部挖30 cm深穴，将生长好的杨树口蘑菌种运到杨树林，脱袋后将菌种放穴内，踩实掩埋，并少量淋水，见图13（图片由赵英同提供）。

图13 杨树林栽培试验Fig.13 Cultivation experiment in Populus L.forest

如图13所示，在出菇管理上主要参照野外环境进行出菇管理，在管理中虽能少量出菇，但受自然条件影响太大，效果并不理想。

7 结论

进行了杨树口蘑采集、菌种分离和驯化研究，主要进行了室内栽培实验。在室内栽培过程中，采用杨树叶、杨树木屑为基本原料进行栽培袋的制作；采用杨树林的土壤和杨树叶为覆盖材料，进行覆土栽培，并进行出菇管理，菌丝爬土后能扭结变粗，形成类似子实体原基的形状。虽然未形成子实体，但为子实体形成提供了有益探索。将来计划用杨树叶、杨树木屑、杨树林土壤为主要基质，采用发酵料和熟料等多种方式，以杨树林的土为主要覆土原料进行进一步的驯化栽培试验，争取在杨树口蘑驯化中有重大突破。