miR-520a-3p对肾癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

翟官忠 刘泽林 王清华 柯帅 郭佳

肾癌是人类泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，男性和女性发病率约占全身恶性肿瘤的5%和3%[1]。手术可显著延长早期肾癌患者的总生存期，但肾癌早期诊断困难，确诊时约30%的患者已出现转移。近30%～35%的局限性和局部进展期肾癌患者术后最终会再次复发或转移，预后极差[2]。靶向治疗可以显著改善晚期和转移性肾癌患者的预后，但靶向治疗中的耐药性问题，尚无有效的解决方案[3]。因此，寻找一种新的肾癌生物标志物或治疗靶点对其早期诊断和治疗具有重要意义。近年来，越来越多的微小RNA(miRNA)被发现在肿瘤的进展和转移中发挥重要作用，且与肿瘤细胞的分化、增殖、侵袭、转移和凋亡密切相关[4]。最新报道显示miR-520a-3p在胃癌、卵巢癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中表达下调，并影响其细胞的生物学行为[5-7]。关于miR-520a-3p在肾癌细胞中的表达情况，以及对肾癌细胞生物学行为的影响，尚未见相关报道。本研究采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-520a-3p在肾癌细胞中的表达水平，通过转染上调miR-520a-3p的表达，观察miR-520a-3p对肾癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，检测相关蛋白表达量变化，并利用生物信息学软件和双荧光素酶报告实验检测其相关靶标。

材料与方法

一、材料

正常肾小管上皮细胞HK2和肾癌细胞系786-O、A498、OS-RC-2及ACHN购自武汉普诺赛公司；RPIM-1640、PBS、Opti-MEM培养液和胰酶购自杭州吉诺公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；miR-520a-3p模拟物、阴性对照序列(miR-NC)、Bcl3-野生型(WT)质粒、Bcl3-突变型(MUT)质粒和引物购自广州锐博公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；qRT-PCR相关试剂盒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翌圣公司；CCK-8试剂盒购自武汉塞维尔公司；Traswell小室购自美国Corning公司；Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒和Matrigel基质胶购自美国BD公司。

二、细胞培养和转染

复苏后的HK2、A498、OS-RC-2、786-O和ACHN细胞用RPIM-1640完全培养液(含10%的胎牛血清和1%青-链霉素)在含5%、CO2的37 ℃的培养箱中培养。待细胞布满培养皿80%的时候用含EDTA的胰酶消化传代。将肾癌细胞786-O和A498各分为对照组、实验组。对照组转染miR-NC，实验组转染miR-520a-3p模拟物，按照Lipofectamine 2000说明书进行转染，转染48 h后进行相关实验。

三、qRT-PCR

采用Trizol法提取肾癌细胞总RNA，Nanodrop 2000C仪检测总RNA浓度及纯度，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，使用PCR试剂盒于实时荧光定量仪上行扩增检测。以U6为内参检测miR-520a-3p表达水平。U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-520a-3p上游引物：5′-CTGTGACCCTCCAGAGGGAAGTA-3′，下游引物5′-ACCGAAACAGTCCAAAGGGAAG-3′。采用2-△△ Ct法分析miR-520a-3p在肾癌细胞中相对表达水平。

四、细胞增殖实验

使用CCK-8法检测肾癌细胞活力。将各组细胞胰酶消化、离心重悬后，加入96孔板中，毎孔加入100 μl细胞悬液(约1×104个细胞)，置于培养箱(37 ℃，5% CO2)内分别培养1、2、3、4 d，随后加入10 μl CCK-8试剂，孵育2 h后于酶标仪下测定毎孔在450 nm处的吸光度(OD)值。

五、细胞迁移和侵袭实验

迁移实验：将各组细胞采用胰酶消化、离心，使用无血清1640培养液重悬后，将200 μl(约5×104个细胞)加入到Transwell 上室，并将600 μl 含10% FBS 1640培养液加入下室中，置于培养箱(37 ℃，5% CO2)培养24 h。然后用4%多聚甲醛固定液固定10 min。用棉签轻擦除去上室残留细胞，0.2%结晶紫染色10 min，PBS清洗后自然风干，将小室倒置于倒置显微镜下观察拍照，随机选取10个视野计算平均细胞数。侵袭实验：把80 μl Matrigel基质胶和无血清培养液以1∶8比例配置的混合物加入到Transwell上室，放置培养箱中2～4 h。后续步骤同迁移实验。

六、细胞凋亡实验

使用不含EDTA的0.25%的胰酶消化细胞，并注意收集悬浮细胞，离心后使用预冷的PBS 润洗 2 次，然后加入稀释的结合缓冲液1 ml，PE 和7-ADD各 5 μl。避光孵育 15 min 后上流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

七、Western blotting检测目的蛋白表达量

转染48 h后，使用细胞裂解液收集各组细胞总蛋白，并上样至十二烷基酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，待电泳结束将蛋白电转至PVDF膜上，经封闭，一抗、二抗孵育，ECL化学发光液显色后，使用Odyssey检测目的蛋白表达量。

八、生物信息学软件预测miR-520a-3p靶基因及双荧光素酶报告实验

通过生物信息学软件PicTar预测，发现miR-520a-3p和Bcl3存在可结合位点。随后将miR-520a-3p模拟物或miR-NC和Bcl3-WT、Bcl3-MUT共转染至肾癌细胞系786-O和A498中，各分为4组： miR-NC+Bcl3-WT、miR-520a-3p+Bcl3-WT、miR-NC+Bcl3-MUT和miR-520a-3p+Bcl3-MUT组。转染后继续培养48 h。以海肾荧光素酶基因作为内参基因，萤火虫荧光素酶作为报告基因，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

九、统计学方法

使用Graphpad Prim 8软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、各肾癌细胞系中miR-520a-3p的表达水平

通过qRT-PCR检测miR-520a-3p在肾癌细胞系中的表达水平，结果显示，对比正常肾小管上皮细胞，miR-520a-3p在各肾癌细胞系中的表达水平均降低(P<0.05)。在786-O、A498细胞中降低最明显(P<0.05)，因此采用786-O和A498细胞进行后续实验。见图1。

图1 miR-520a-3p在HK2细胞和各肾癌细胞系中的表达水平(与HK2细胞相比 *P<0.05)

二、转染miR-520a-3p模拟物后各组肾癌细胞miR-520a-3p的表达水平

通过qRT-PCR检测转染后miR-520a-3p表达水平，结果显示，miR-520a-3p在 786-O细胞中对照组和实验组的表达水平分别为(1.13±0.12)和(486.20±56.37)，P<0.05；在A498细胞中对照组和实验组的表达水平分别为(1.09±0.18)和(517.30±62.51)，P<0.05。实验组miR-520a-3p表达水平明显上升。见图2。

图2 转染后各组786-O和A498细胞中miR-520a-3p的表达水平(与对照组相比 *P<0.05)

三、转染miR-520a-3p模拟物后对肾癌细胞增殖能力的影响

使用CCK-8法连续测定4 d各组细胞的OD值，然后绘制成图。结果显示，在786-O和A498两种细胞系中，与对照组相比，实验组细胞在第3、4天活力明显受到抑制(P<0.05)。见图3。

图3 CCK-8法检测转染后各组786-O和A498细胞的OD值变化(与对照组相比 *P<0.05)

四、转染miR-520a-3p模拟物后对肾癌细胞迁移能力的影响

Transwell迁移实验结果显示，786-O细胞中对照组和实验组迁移细胞数分别为(205.76±8.37)和(113.83±6.45)个，P<0.05；A498细胞中对照组和实验组迁移细胞数分别为(193.52±9.46)和(97.49±5.73)个，P<0.05。实验组迁移细胞数明显下降。见图4。

图4 Transwell小室检测转染后786-O和A498细胞的迁移变化(与对照组相比 *P<0.05)

五、转染miR-520a-3p模拟物后对肾癌细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示，786-O细胞中对照组和实验组侵袭细胞数分别为(175.31±4.13)和(74.67±4.29)个，P<0.05；A498细胞中对照组和实验组侵袭细胞数分别为(194.89±7.61)和(81.13±6.24)个，P<0.05。实验组侵袭细胞数明显下降。见图5。

图5 Transwell小室检测转染后786-O和A498细胞的侵袭变化(与对照组相比 *P<0.05)

六、转染miR-520a-3p模拟物后对肾癌细胞凋亡水平的影响

流式细胞术测定结果显示，786-O细胞中对照组和实验组凋亡率分别为(8.69±0.86)%、(21.75±1.96)%，P<0.05；A498细胞中对照组和实验组凋亡率分别为(7.71±0.84)%、(19.73±1.27)%，P<0.05。实验组细胞凋亡水平明显升高。见图6。

图6 流式细胞术检测转染后786-O和A498细胞的凋亡水平(与对照组相比 *P<0.05)

七、转染miR-520a-3p模拟物后肾癌细胞N-cadherin、E-cadherin、Bcl2、Bcl3蛋白表达量

Western blotting结果显示，与对照组相比，两实验组细胞N-cadherin、Bcl2、Bcl3蛋白表达量均明显降低，E-cadherin蛋白表达量均明显增高。见图7。

图7 Western blotting检测转染后各组细胞N-cadherin、E-cadherin、Bcl2和Bcl3蛋白表达量

八、miR-520a-3p靶基因预测与验证

使用PicTar预测分析miR-520a-3p靶基因，结果表明miR-520a-3p与Bcl3存在可结合位点(图8)。进一步使用双荧光素酶报告实验验证，结果显示，miR-520a-3p模拟物和Bcl3-WT共转染后荧光素酶活性明显低于miR-NC和Bcl3-WT共转染组[786-O：(0.22±0.06)vs(1.00±0.03)，P<0.05)；A498：(0.27±0.03)vs(1.00±0.04)，P<0.05)]；miR-520a-3p模拟物或miR-NC和Bcl3-MUT共转染后荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。见图9。

图8 miR-520a-3p和Bcl3结合位点预测

图9 双荧光素酶基因报告检测miR-520a-3p模拟物与Bcl3-WT/MUT共转染后786-O和A498细胞的荧光素酶活性(与miR-NC组相比 *P<0.05)

讨 论

miRNA是一种大小约为22个核苷酸的非编码RNA，通过碱基互补配对以完全或不完全方式靶向mRNA，影响靶基因mRNA的翻译水平，其异常表达在癌症的发生和进展中起着至关重要的作用[8]。研究发现，miR-520a-3p在多种恶性肿瘤中低表达，并发挥着抑癌基因作用[5-7, 9-12]。为了研究miR-520a-3p在肾癌细胞中表达情况，本研究通过qRT-PCR对比HK2和多种肾癌细胞系中miR-520a-3p表达水平，发现miR-520a-3p在肾癌细胞中低表达。

多项研究表明上调miR-520a-3p表达可影响肿瘤细胞的生物学行为。上调肿瘤细胞中miR-520a-3p表达后，胃癌细胞增殖能力明显降低[5]；卵巢癌细胞增殖和侵袭能力明显降低，细胞凋亡率明显上升[6]；乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低，细胞凋亡率显著上升[7]。为了探究miR-520a-3p对肾癌细胞的影响，我们通过转染miR-520a-3p模拟物上调肾癌细胞系786-O和A498中miR-520a-3p的表达，发现肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显受抑制，细胞凋亡率上升。我们通过Western blotting验证786-O和A498中相关蛋白变化，发现N-cadherin和Bcl2蛋白表达量均明显降低，E-cadherin蛋白表达量均明显增高，已有研究证明，N-cadherin和E-cadherin的异常表达与肿瘤的迁移和侵袭密切相关[13-14]，Bcl2可通过调节线粒体外膜的通透性，将凋亡因子释放到细胞质中，从而诱导细胞凋亡[15]，提示miR-520a-3p可通过调控肾癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡进程而参与肾癌的发生、发展过程。

近期不断有学者发现miR-520a-3p可负向调控肿瘤高表达基因，进而影响肿瘤细胞的生物学行为。Bi等[10]发现，miR-520a-3p通过下调JAK1表达，抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡。Wang等[11]发现miR-520a-3p通过下调LIMK1表达，抑制肝癌细胞的生物学行为。Liu等[12]研究发现，miR-520a-3p通过下调HOXD8表达，抑制非小细胞肺癌细胞的生长和癌症干细胞的表型。为了进一步研究miR-520a-3p在肾癌中的作用靶点，我们通过生物信息学软件预测发现Bcl3可能是miR-520a-3p的靶基因。Bcl3在前期已被证实是B细胞慢性淋巴细胞白血病中的原癌基因[16]，最新研究表明，其在多种实体肿瘤中高表达，并通过多种信号通路影响肿瘤的发生、发展及转移[17-19]。 Dai等[20]通过生物信息学分析发现Bcl3在肾癌组织中高表达，Bcl3的高表达与患者不良预后密切相关。本研究通过双荧光素酶报告实验发现，miR-520a-3p可直接靶向Bcl3，并通过Western blotting 进一步证实转染miR-520a-3p模拟物后Bcl3蛋白表达含量明显降低。我们下一步拟通过干扰肾癌细胞中miR-520a-3p和Bcl3的表达，研究miR-520a-3p与Bcl3调控关系及相关通路。

综上所述，miR-520a-3p在肾癌细胞系中表达水平显著降低。在肾癌细胞系786-O和A498中，过表达miR-520a-3p可抑制其增殖、迁移和侵袭能力，促进细胞凋亡。Bcl3是miR-520a-3p的靶基因之一。本研究结果提示miR-520a-3p可能在肾癌的发展和转移中发挥着重要作用，探讨miR-520a-3p的调控机制可能为研究肾癌发生、发展提供新的思路。