苗药黑骨藤对胶原诱导性关节炎大鼠的作用研究

刘 耀，胡 蝶，徐 剑，郭 玲，程 纯，张永萍

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要临床表现的自身免疫病[1]，目前，我国的发病率约为0.4%[2]，致残率5年内高达30%～50%[3]。由于该病的发病机制尚未完全明确，缺乏有效的根治及预防措施。临床上多采用非甾体抗炎药、糖皮质激素、抗风湿药、生物制剂等药物对其进行非特异性对症治疗，存在着不良反应多、费用高等诸多缺点。

苗医称RA为“mongb hsongd jenl”(音译：蒙冲静)，属于苗医身架病症中“钻节风”的范畴[4]，认为其发病多与先天不足、气候寒冷、久居湿地、劳累过度等因素有关[5]，早期多以寒湿痹阻痹证为基本证型[6]，苗医药在治疗RA方面历史悠久，具有独特的治疗优势。黑骨藤(PeriplocaforrestiiSchltr.)是贵州苗族治疗风湿与类风湿疾病的常用药物之一，具有通络、活血、祛风等功效[7]。研究表明，黑骨藤乙醇提取物对人类风湿关节滑膜成纤维细胞(RASF)的增殖及环氧化酶-2(COX-2)、前列腺素2(PGE2)的表达水平具有明显抑制作用[8]。黑骨藤多糖部位HGT-5A可抑制T细胞活化增殖，对细胞免疫反应具有良好的抑制作用[9]。本实验通过建立CIA大鼠模型，观察黑骨藤乙醇提取物的治疗作用，并探讨其作用机制，以期为苗药黑骨藤的深层次开发提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SD大鼠雌雄各半，8周龄，体质量150～180 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，合格证编号：SCXK(湘)2014-0011，动物房环境：温度18～26 ℃，相对湿度40%～70%。

1.2 药物与试剂

弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司，牛Ⅱ型胶原溶液购自美国Chondrex公司，大鼠IL-6、TNF-α检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，lgA、lgM、lgG检测试剂盒购自Blue Gene公司，雷公藤多苷片购自贵州汉方制药有限公司，黑骨藤药材采自贵阳市花溪区，经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为正品。

1.3 仪器与设备

LY70倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，全波长酶标仪(美国Thermo Fisher公司)，TGL-16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，MX-S涡旋仪(美国Scilogex公司)。

2 方法

2.1 供试品的制备

取黑骨藤药材，加入80%的乙醇回流提取2次，固液比为10，每次1 h，合并提取液，浓缩挥干溶剂后，用蒸馏水配制成各给药所需剂量的混悬液，既得。

2.2 分组及造模

将36只雌雄各半的SD大鼠随机分为6组：A.正常组；B.雷公藤多苷阳性组；C.模型组；D.低剂量给药组；E.中剂量给药组；F.高剂量给药组。除正常组外，其余各组采用胶原诱导的方法建立CIA大鼠模型。取牛Ⅱ型胶原溶液(浓度2 mg/mL)与等体积的弗氏不完全佐剂混合，制成浓度为1 mg/mL的胶原乳剂，大鼠尾根部皮内注射胶原乳液0.2 mL，7天后加强免疫1次[10]。

2.3 给药

免疫后第1天，按10 mL/kg进行分组灌胃给药，阳性组给予10 mg/kg雷公藤多苷，黑骨藤高、中、低剂量组给予浓度为2.1 g(生药)/kg、1.05 g(生药)/kg、0.525 g(生药)/kg的黑骨藤醇提物混悬液，正常组与模型组灌胃同等剂量的生理盐水，连续灌胃28天。

2.4 大鼠组肿胀度及关节炎指数测定

将各组大鼠踝关节进行标记，每周采用排水法，测量其标记处以下部位的排水体积，记录各组大鼠足肿胀的变化程度，并采用5级评分法评价大鼠四肢关节炎指数(AI)[11]。

2.5 大鼠踝关节滑膜组织病变情况

灌胃4周后，麻醉处死大鼠，取各组大鼠右后踝关节滑膜组织，用4%的中性甲醛固定2天，置于EDTA溶液中脱钙处理，选用不同浓度乙醇进行梯度脱水、采用石蜡进行包埋、切片，进行HE染色，观察大鼠踝关节组织病理情况。

2.6 大鼠血清中细胞炎症因子及免疫球蛋白的测定

灌胃4周后，麻醉处死各组大鼠，取全血静置20 min，以3 000 r/min离心15 min，采用ELISA法，严格按试剂盒说明书进行操作，以酶标仪检测各组大鼠血清中细胞炎症因子TNF-α、IL-6水平及免疫球蛋白lgA、lgM、lgG表达情况。

2.7 统计分析

3 结果

3.1 大鼠AI评分比较

造模1周后，与正常组比较，模型组及各给药组大鼠AI评分值均显著升高(P<0.01)；灌胃治疗2周后，与模型组比较，雷公藤多苷阳性组与黑骨藤各给药组大鼠AI评分值均显著降低(P<0.01)。雷公藤多苷阳性组与黑骨藤各给药组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，表明其治疗作用相当；灌胃治疗3周后，各给药组大鼠AI评分值逐渐下降。结果见表1。

表1 各组大鼠AI评分结果

3.2 大鼠足肿胀度比较

造模1周后，与正常组比较，模型组及各给药组大鼠足肿胀度均显著增加(P<0.01)；造模2周后，模型组大鼠足肿胀度达到峰值，随后逐渐下降；灌胃治疗2周后，黑骨藤高、中、低剂量组以及雷公藤多苷阳性组均能显著抑制大鼠足肿胀(P<0.01)；灌胃治疗3周后，黑骨藤高剂量组与正常组足肿胀度相当(P>0.05)。结果见表2。

表2 各组大鼠足肿胀度变化

3.3 大鼠血清中细胞炎症因子TNF-α、IL-6表达水平比较

灌胃治疗4周后，模型组大鼠IL-6和TNF-α表达水平较正常组显著上升(P<0.01)，表明造模成功；与模型组比较，雷公藤多苷阳性组、黑骨藤给药组可显著抑制CIA大鼠血清中IL-6和TNF-α表达水平(P<0.01)；其中黑骨藤高剂量组与雷公藤多苷阳性组在IL-6表达上无统计学差异(P>0.05)，表明黑骨藤高剂量组与雷公藤多苷阳性组下调IL-6作用相当。黑骨藤高、中剂量组较雷公藤多苷阳性组在TNF-α表达上具有统计学差异(P>0.01)，且黑骨藤高、中剂量组下调TNF-α作用优于阳性组。结果见表3。

表3 各组大鼠血清IL-6，TNF-α含量水平

3.4 大鼠血清中免疫球蛋白lgA、lgM、lgG表达水平比较

灌胃治疗4周后，与模型组比较，雷公藤多苷阳性组与黑骨藤高、中剂量组血清中lgM含量显著降低(P<0.05)。雷公藤多苷阳性组与黑骨藤给药组血清中lgA、lgG含量显著降低(P<0.05)；雷公藤多苷阳性组与黑骨藤高、中剂量组比较，差异无统计学意义(P<0.05)，表明黑骨藤高、中剂量组与雷公藤多苷阳性组治疗作用相当。结果见表4。

表4 各组大鼠血清lgA、lgM、lgG含量水平

3.5 大鼠踝关节组织病变情况

正常组大鼠踝关节滑膜组织表面光滑，滑膜细胞排列整齐无增生，未见炎症细胞浸润及血管增生。模型组大鼠踝关节间隙明显变窄，滑膜表面呈现粗糙感，层次较为紊乱，滑膜细胞及血管增生，可见大量炎症细胞浸润，形成血管翳，软骨退变。与模型组比较，雷公藤多苷阳性组及黑骨藤各给药剂量组软骨退变、骨破坏、滑膜细胞及血管增生明显减轻，炎症细胞浸润情况明显减少，其病理状况得到显著改善。

A.正常组；B.模型组；C.阳性组；D.黑骨藤低剂量组；E.黑骨藤中剂量组；F.黑骨藤高剂量组

4 讨论

类风湿关节炎是一种病因复杂、机制尚不明确的自身免疫疾病，主要表现为炎症细胞浸润、滑膜细胞及血管增生、软骨退变及骨破坏等。RA属于中医“痹证”范畴，中医药以辨证论治为主，具有多途径、多环节、多靶点的作用。雷公藤、青风藤、马钱子等中药已被广泛应用于RA的治疗，其中中药有效成分雷公藤多苷对RA具有良好的治疗作用，作用机制明确，已开发成中药新药并在临床上广泛使用，故本实验选择雷公藤多苷片为阳性药物进行研究。

胶原诱导性关节炎大鼠模型的病理特征及发病过程与RA类似，为关节滑膜组织增生、关节软骨退变及骨侵蚀破坏[12]，是国际公认研究RA的理想动物模型，因此本研究选用CIA大鼠模型进行实验，研究结果表明，与正常组大鼠比较，模型组大鼠AI评分值及其足肿胀程度均明显升高，血清中细胞炎症因子IL-6、TNF-α及免疫球蛋白lgA、lgM、lgG的表达水平均显著升高，同时观察其足踝关节组织，可见大量炎症细胞浸润、关节软骨退变、滑膜细胞增生，及血管翳形成，提示本实验造模成功。

TNF-α作为多效的细胞因子，主要由活化巨噬细胞产生，可通过激活内皮细胞、白细胞和滑膜细胞，以及促进其他细胞因子和趋化因子的扩增参与各种炎症反应，同时也可抑制成骨细胞的分化和功能，进一步促进破骨细胞的生成，在RA的发病机制中展示出了多种相关效应功能。IL-6作为RA发病机制中的关键细胞因子，由活化巨噬细胞及成纤维滑膜细胞产生，与TNF-α有相似作用，可使免疫系统细胞、皮内细胞、破骨细胞活化，产生急性期蛋白，参与炎症反应[13]。本研究结果显示，与模型组比较，雷公藤多苷阳性组及黑骨藤给药组血清中IL-6、TNF-α表达水平显著降低，黑骨藤高剂量组与雷公藤多苷阳性组下调IL-6作用相当，且黑骨藤高、中剂量组下调TNF-α作用优于阳性组。

RA作为一种自身免疫疾病，其病情的发展与机体自身免疫功能紊乱密切相关[14]。致病因子会诱导体内Th细胞产生相关细胞因子，并激活B细胞，使其产生抗体，抗原与抗体结合生产免疫复合物，导致出现免疫反应，引发组织受损，其表达水平的升高可引起一系列免疫反应[15]。本研究结果显示，与模型组比较，雷公藤多苷阳性组与黑骨藤高、中剂量给药组血清中lgA、laM、lgG含量明显降低；黑骨藤高、中剂量给药组与雷公藤多苷阳性组治疗作用相当。

综上所述，本研究构建CIA大鼠模型，采用灌胃黑骨藤80%乙醇提取物的方式进行药物干预，结果显示黑骨藤可缓解关节炎症反应，改善软骨退变及骨破坏，其作用机制可能与其下调细胞炎症因子IL-6、TNF-α及免疫球蛋白lgA、lgM、lgG的表达水平有关。本研究还提示黑骨藤与雷公藤具有相近的抗RA作用，但其抗RA药效物质基础、作用机制及作用靶点都尚待进一步探索。