针眼外敷中药包质量控制研究

谭朝丹，朱建勇，林 恺，李 婷，楼 冰，公丕君，顾伟鹰

(上海中医药大学附属第七人民医院，上海 200137)

针眼外敷方由决明子、青葙子、密蒙花、金银花、栀子、赤芍、四季青、川芎、木香、蒲公英、皂角刺、夏枯草、蝉蜕、芒硝、冰片15味中药组成。前期临床研究表明，采用针眼外敷中药包热敷治疗麦粒肿患者，可清热解毒止痛、祛瘀化脓消肿，临床疗效显著，安全性较高。为更好地控制中药包质量，制定相应的质量标准，本研究特制备了3批针眼外敷包样品，采用薄层色谱法对针眼外敷包中的君药决明子、臣药金银花、栀子和赤芍进行了定性鉴别；采用高效液相色谱法对处方君药密蒙花中蒙花苷、臣药栀子中栀子苷及赤芍中的芍药苷进行了含量测定，为制订针眼外敷包质量标准，更好地进行制剂的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 药物与试剂

本研究所用针眼外敷方15味中药，全部按照2015版《中国药典》中药饮片相关检测项进行鉴别和检测，经检验饮片质量合格。将饮片打碎，过80目筛，放入高级医用无纺布定制的布袋中封口，制成针眼外敷中药包(批号：20190902，20190904，20190906)，由上海康桥药业有限公司制备。

对照品蒙花苷(批号111528-201911)、橙黄决明素(批号111900-201605)、栀子苷(批号110749-201919)、芍药苷(批号110736-201943)、绿原酸(批号110753-201817)、大黄酚(批号110796-201922)均购于中国食品药品检定研究院；甲醇(色谱纯)购自美国Fisher公司，其余为分析纯。

1.2 仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1260，美国安捷伦)；多功能紫外分析仪(BD-II，北京启航博达)；电子天平(CP225D，北京赛多利斯)；超声清洗仪(DL720-A，上海之信)；电热恒温水浴锅(HWS28，上海一恒)；旋转蒸发仪(RV-10，德国IKA)；循环水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ)，郑州博科)；电热恒温干燥箱(DNG-9140A，上海精宏)。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 决明子的薄层鉴别 取针眼外敷包粉末5 g，加50%甲醇水溶液50 mL，进行索氏提取，收集提取液并浓缩至无醇，加入蒸馏水50 mL，用水饱和正丁醇振摇提取2次(各50 mL)，合并正丁醇液，并挥干，残渣加甲醇2 mL，加热溶解，作为供试品溶液。另取橙黄决明素、大黄酚对照品，分别加甲醇，制成1 mg/mL溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验(通则0502)[1-2]，吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一GF254硅胶薄层板上，展开剂：石油醚(60～90 ℃)-丙酮(4∶1)，展开，晾干，先置于日光灯下检视(图1A)，再置于氨蒸气中熏蒸(图1B)。在与对照品色谱相应的位置上，供试品色谱显相同颜色的斑点，粉红色(大黄酚)和亮黄色(橙黄决明素)，阴性未见干扰。

注：1.橙黄决明素对照品；2.大黄酚对照品；3.20190902批；4.缺决明子阴性样品

2.1.2 金银花的薄层鉴别 取针眼外敷包粉末5 g，加1%盐酸水溶液50 mL，超声30 min，滤过，取滤液，用水饱和正丁醇振摇提取2次(各50 mL)，合并正丁醇液，并挥干，残渣加甲醇2 mL，加热溶解，作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加50%甲醇，制成1 mg /mL，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验(通则0502)[3-4]，吸取供试品和对照品溶液各5 μL，分别点于同一G254硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)作为展开剂，展开，晾干，置365 nm紫外光灯下检视。在与对照品色谱相应的位置上，供试品色谱显相同颜色的荧光斑点；而阴性对照未见干扰(图2)。

注：1.绿原酸对照品；2.20190902批；3.缺金银花阴性样品

2.1.3 栀子的薄层鉴别 取针眼外敷包粉末5 g，加50%甲醇水溶液50 mL，索氏提取，收集提取液，浓缩至无醇，再加入蒸馏水50 mL，用水饱和正丁醇振摇提取2次(各50 mL)，合并正丁醇液，并挥干，残渣加甲醇2 mL，加热溶解，作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加甲醇，制成1 mg /mL，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验(通则0502)[5]，吸取供试品溶液和对照品溶液各5 μL，分别点于同一G254硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)作为展开剂，展开，晾干，先置254 nm紫外光灯下检视(图3A)；再喷以10%硫酸乙醇溶液，加热(105 ℃)至斑点清晰显色(图3B)。在与对照品色谱相应的位置上，供试品色谱显相同颜色斑点，阴性未见干扰。

注：1.栀子苷对照品；2.20190902批；3.缺栀子阴性样品。

2.1.4 赤芍的薄层鉴别 取针眼外敷包粉末5 g，加50%甲醇水溶液 50 mL，索氏提取，收集提取液，浓缩至无醇，再加入蒸馏水50 mL，用水饱和正丁醇振摇提取2次(各50 mL)，合并正丁醇液，挥干，残渣加甲醇2 mL，加热溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇，制成1 mg /1 mL，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验[6]，吸取供试品溶液和对照品溶液各5 μL，分别点于同一G254硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)为展开剂，展开，晾干；再喷以5%香草醛硫酸，加热(105 ℃)至斑点显色清晰。在与对照品色谱相应的位置上，供试品色谱显相同颜色斑点，而阴性未见干扰，见图4。

注：1.芍药苷对照品；2.20190902批；3.缺赤芍阴性样品。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：安捷伦ZORBAX Elipse XDB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(流动相A)-0.4%磷酸水(流动相B)，洗脱梯度见表1；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：326 nm、238 nm；进样量：10 μL。

表1 梯度洗脱

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取蒙花苷适量，配制成浓度为40 μg/mL甲醇溶液；精密称取栀子苷和芍药苷对照品适量，加甲醇，配制成浓度分别为100 μg/mL、100 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取1 g左右针眼外敷包粉末，加80%甲醇溶液25 mL，超声10 min，放冷后补足体积，采用0.45 μmol/L微孔滤膜滤过，取续滤液。

2.2.4 阴性对照品溶液的制备 分别取除密蒙花之外的处方药材、除栀子和赤芍之外的处方药材，按照工艺制备成阴性样品，按“2.2.3”项下方法，分别制备缺密蒙花和缺栀子、赤芍的阴性样品。

2.3 专属性实验

2.3.1 蒙花苷 分别吸取蒙花苷对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，按“2.2.1”项进行分析，密蒙花苷与其相邻峰分离系数均>1.5，理论塔板数符合要求，阴性无干扰，专属性良好，见图5。

注：A.供试品溶液；B.对照品溶液；C.阴性对照品溶液；1.蒙花苷对照品

2.3.2 栀子苷、芍药苷 分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，按“2.2.1”项进行分析，栀子苷、芍药苷与其相邻色谱峰分离系数均>1.5，理论塔板数符合要求，阴性无干扰，专属性良好，见图6。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取1、1.25、2.5、5、10、12.5 μL蒙花苷对照品溶液，以及栀子苷和芍药苷混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按照“2.2.1”项进行测定，记录峰面积。以进样量为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得到各组分线性回归方程、相关系数r和线性范围。在各自线性范围内，各成分线性关系良好，见表2。

注：A.供试品溶液；B.对照品溶液；C.阴性对照品溶液；2.栀子苷；3.芍药苷

表2 三种主成分的线性关系考察结果

2.4.2 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液10 μL，重复进样6次，按“2.2.1”项色谱条件检测，记录峰面积，计算RSD值，结果表明所用方法精密度良好，见表3。

表3 精密度试验结果

2.4.3 重复性试验 取“2.2.3”项配制的供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样10 μL，分别进样6次，记录蒙花苷、栀子苷、芍药苷峰面积，计算RSD值，结果表明所用方法重复性良好，见表4。

表4 重复性试验结果

2.4.4 稳定性试验 取“2.2.3”项配制的供试品溶液，分别在室温放置0、4、10、16、24、32 h。按“2.2.1”项色谱条件进样10 μL，测定峰面积，计算RSD值，结果见表5，表明供试品溶液在32 h内稳定。

表5 稳定性试验结果

2.4.5 加样回收率试验 取已知指标成分含量的20190902批样品6份，在线性范围内分别加入一定量的蒙花苷、芍药苷、栀子苷对照品溶液，按“2.2.1”项色谱条件测定含量，结果表明所用方法回收率良好，见表6。

表6 加样回收试验结果

2.5 样品的测定

取3批针眼外敷包样品(批号20190902、20190904、20190906)，按“2.2.3”项下方法制备供试样品溶液，分别按“2.2.1”项下色谱条件测定蒙花苷、栀子苷、芍药苷的含量。结果见表7。

表7 针眼包中蒙花苷、栀子苷和芍药苷的含量测定结果

3 讨论

根据眼科古籍《审视瑶函》记载：“土疳之病，俗号偷针，谓睥上生毒也。脾家燥热，瘀滞难行。微则自然消散，甚则除血流脓。”[7]治则当以清热解毒、疏散风热，兼顾祛瘀排脓、健脾消肿，据此拟定“针眼外敷方”，作为医院协定方，用于治疗本院眼科麦粒肿患者。全方共15味中药：决明子、青葙子、密蒙花、金银花、栀子、赤芍、四季青、川芎、木香、蒲公英、皂角刺、夏枯草、蝉蜕、芒硝、冰片。决明子味甘、苦、微咸，性寒，清肝明目；青葙子味苦，微寒，清肝，明目，退翳；密蒙花味甘，微寒，清热泻火，养肝明目，退翳。三药均归肝经，可清肝热，肝开窍于目，肝热则目肿赤生毒，三药共为君药，共奏清退肝热、解毒明目之功，君药内服或外用治疗麦粒肿均有文献记载[8-11]。臣药四季青、金银花、栀子、赤芍，清内热、疏风热、泻火毒，并可凉血活血。川芎、木香、蒲公英、皂角刺、夏枯草、蝉蜕、芒硝共为佐药，冰片为使药。将上述针眼外敷方打粉制成中药包，辅以热蒸疗法，与氧氟沙星眼膏合用治疗早期麦粒肿，疗效显著。

本研究针眼包中决明子(君药)、金银花(臣药)、栀子(臣药)、赤芍(臣药)的薄层鉴别，主要参考2015 年版《中国药典》(一部)的方法[12]。在供试品处理上，根据所测定成分的极性差异采取特殊处理，决明子中的橙黄决明素，大黄酚、栀子中的栀子苷，赤芍中的芍药苷属于极性物质，先采用50%甲醇提取，再采用水饱和正丁醇萃取，从而进行有效分离并鉴别，同时样品采用相同的处理方法，简化了薄层鉴别实验操作。金银花中的绿原酸属于酸性物质，先用1%盐酸进行提取，再用水饱和正丁醇萃取。鉴别绿原酸、栀子苷和芍药苷，采用相同的薄层展开剂，结果分离度好，进一步简化了薄层鉴别流程，且有较强的专属性。

本研究中蒙花苷(君药密蒙花指标成分)、栀子苷(臣药栀子指标成分)和芍药苷(臣药赤芍指标成分)的含量测定方法主要参考2015年版《中华人民共和国药典》(一部)密蒙花、栀子及赤芍项下含量测定方法[12]及相关文献[13]，经过对紫外检测波段调试，蒙花苷的含量测定采用326 nm波长，而栀子苷和芍药苷，可混合对照品溶液，采用238 nm波长。最终，1种样品2个检测波长，同时测定针眼包中3个主要指标性成分，简便了含量测定方法。

本研究建立了针眼外敷包4种中药薄层鉴别及其中3种有效成分的含量测定方法，实验方法简便可行，灵敏度高，重现性好，可用于针眼外敷包的质量控制。