蔓荆子药材与炒蔓荆子指纹图谱对比研究

瞿昊宇，陈光宇，佘义勇，何 群，谢梦洲*

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省药食同源功能性食品工程技术研究中心，湖南 长沙 410208；3.中医诊断学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；4.中医心肺病证辨证与药膳食疗重点研究室，湖南 长沙 410208)

蔓荆子为辛凉解表常用中药，以“蔓荆实”之名始载于《神农本草经》，列为上品[1]，为马鞭草科植物蔓荆VitextrifoliaL.或单叶蔓荆VitextrifoliaL.var.simplicifoliacham的干燥成熟果实。主要产于江西、山东、福建、广西、广东、浙江、安徽等地，分布广、产量大，其道地药材产区为山东(道地药材是指具有特定产区，货真质优的中药材)，味辛、苦，微寒，归膀胱、肝、胃经。具有疏散风热、清利头目之功效，用于风热感冒头疼、齿龈肿痛、目赤多泪、目暗不明、头晕目眩。为历版中国药典收载，以炮制品(炒蔓荆子)入药，炒蔓荆子多用于风热感冒头痛类的中药处方中。现代药理研究表明，蔓荆子具镇痛、抗炎、降压、抗菌、祛痰、抗肿瘤等作用[2-3]。蔓荆子主要含挥发油和黄酮类成分，挥发油主要有茨烯、蒎烯、α-菲兰烯、香桧烯、B-蒎烯等；黄酮类成分是蔓荆子镇痛、抗菌、消炎等药理作用的主要药效成分。以蔓荆子黄素为代表，还有紫花牡荆素、木樨草素、篙黄素索多甲氧基黄酮、木挥草索-7-葡萄糖酯、四轻基甲氧基黄酮等。一般认为蔓荆子经炒制后，其辛散之性较为缓和，质变酥脆，利于粉碎和有效成分的煎出。前期对蔓荆子炒制工艺进行了研究，结果表明，蔓荆子炒制后提高了有效成分的溶出，浸出物含量与蔓荆子黄素含量较生品均有所增加，其量值传递率高，表明优选出来的炒蔓荆子炮制工艺科学、合理、稳定、可靠、可行，但仅以浸出物含量与蔓荆子黄素含量为评价指标不能全面反映蔓荆子炒制前后质量属性的改变，故为比较蔓荆子炒制前后化学成分的变化及质量传递信息，评价炒蔓荆子的质量属性，本文通过研究蔓荆子炒制前后指纹图谱的改变，为炒蔓荆子质量控制及质量标准的建立提供依据。

1 仪器与药材

1.1 仪器

Ultimate 3000高效液相色谱系统(赛默飞世尔科技(中国)有限公司；包括G1316A四元梯度泵、G1313A标准型自动进样器、G1316A恒温箱、G1314A紫外检测器、Agilent Chemstation 色谱工作站)；中文液晶台式超声波清洗器(昆山美美超声仪器有限公司)；ME204E型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；TCS-100型电子台秤(上海乾峰电子仪器有限公司)；PW135型中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；SHH.W21电子三用水箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；QY-1中药切片机(温州顶历医疗器械有限公司)；HWS-80B型恒温恒湿培养箱(天津市意博高科实验仪器厂)；101-0AB型电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；LC-E096P灶头(电陶炉，广东顺德忠臣电器有限公司)。

1.2 药材及试剂

28批蔓荆子原药材经王智教授鉴定为单叶蔓荆V.trifoliaL.var.simplicifoliaCham.的干燥成熟果实；炒蔓荆子(由本实验室自制)；蔓荆子黄素对照品(批号：111554-201705)购于中国食品药品检定研究院(国家药品标准物质)，供含量测定用(蔓荆子黄素含量98.3%)；甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 炒蔓荆子炮制方法

取蔓荆子药材，按2020版《中国药典》一部363页蔓荆子药材项下检查符合有关规定，无虫蛀、无霉变，有清香味，挑选除去杂草及碎石粒，20目筛筛选，风选簸除去杂质、灰屑及部分宿萼碎片，净制处理，将炒药锅加热使其升温至100 ℃，取100 g前处理的蔓荆子药材投入锅中，炒制5 min，取出，晾凉，20目筛筛选，再风选簸除去杂质、灰屑及部分宿萼碎片。

2.2 色谱条件与系统适用性试验[4-6]

液相色谱柱(月旭，Ultimate©XB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相；洗脱方式：线性梯度，0～70 min(20%～80%甲醇)检测波长为258 nm，流速：1.0 mL·min-1，进样量：10 μL；柱温：30 ℃，理论板数按蔓荆子黄素峰计算应不低于2 000。

2.3 供试品溶液的制备

分别取28批各批蔓荆子原药材和炒蔓荆子样品粉末(过三号筛)约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，置水浴中加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心7 min，取上清液过0.22 μm滤膜至进样小瓶中，即得供试品溶液。

2.4 阴性对照供试品溶液的制备

取缺蔓荆子原药材和炒蔓荆子样品的甲醇溶剂，按“2.2”项同法制备，即得阴性供试品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱峰，各共有峰相对保留时间和峰面积的比值大体一致，RSD=2.896%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取同一批样品6份，按“2.2”项方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，测定其HPLC谱图，各共有峰相对保留时间和峰面积的比值大体一致，RSD=2.947%，表明本分析方法的重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48 h进样，测定其HPLC谱图，各共有峰相对保留时间和峰面积的比值基本一致，RSD=1.853%，表明供试液在48 h内稳定。

2.6 指纹图谱色谱峰的标定[7-8]

取蔓荆子黄素约10 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，精密加入甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含蔓荆子黄素1.07 mg的母液1；精密移取1 mL蔓荆子黄素母液1置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含蔓荆子黄素0.107 mg的母液2；精密移取3 mL蔓荆子黄素母液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含蔓荆子黄素32.1 μg的对照品溶液，过0.22 μm微孔滤膜至进样小瓶中，进行高效液相色谱分析。照“2.1”项和“2.3”项下处理的蔓荆子药材及炒蔓荆子供试品溶液，“2.4”项下阴性对照溶液，“2.6”项下蔓荆子黄素对照品溶液的色谱见图1-图4。

图1 阴性对照品(甲醇空白)

图2 蔓荆子黄素对照品

图3 蔓荆子原药材供试品

图4 炒蔓荆子供试品

2.7 蔓荆子原药材和炒蔓荆子的HPLC指纹图谱及技术参数(相似度的计算)

采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》，对28批单叶蔓荆子原药材和炒蔓荆子的指纹图谱进行分析[7-9]，设定时间窗宽度0.1 min、多点校正、谱峰匹配，以MJZ-01及CMJZ-01色谱图为药材及炮制品的参照图谱，药材及炮制品各15批不同来源蔓荆子指纹图谱见图5-图6。由图可知，每批蔓荆子原药材或炒蔓荆子含有8个共有色谱峰，其中保留时间为66.0 min处的8号色谱峰为蔓荆子黄素对照品的色谱峰。

图5 28批蔓荆子原药材供试品

图6 28批炒蔓荆子供试品

28批蔓荆子药材和炒蔓荆子各样品指纹图谱与生成的对照图谱的相似度计算结果，见表1。

对表1中28批蔓荆子原药材和炒蔓荆子指纹图谱相似度进行配对t检验，得配对样本相关系数γ=0.968 4，其均值差异检验t=0.120 6，df=27，P=0.904 9，结果表明蔓荆子原药材和炒蔓荆子指纹图谱大体一致，蔓荆子炒制前后其化学成分变化无统计学差异(P>0.05)。

表1 蔓荆子原药材和炒蔓荆子的指纹图谱相似度分析结果

2.8 蔓荆子药材和炒蔓荆子中蔓荆子黄素含量分析与比较

15批符合2020版《中国药典》蔓荆子药材质量标准规定的蔓荆子药材和炒蔓荆子中蔓荆子黄素含量结果，见表2。

对表2中15批蔓荆子原药材和炒蔓荆子中蔓荆子黄素含量进行配对t检验，得配对样本相关系数γ=0.959 6，其均值差异检验t=4.123 7，df=14，P=0.001 0，结果表明蔓荆子原药材经过炮制后所得的炒蔓荆子，其蔓荆子含量显著增加，具有统计学意义(P>0.05)。

表2 蔓荆子原药材和炒蔓荆子的指纹图谱相似度分析结果

3 小结与讨论

本研究建立了以《中国药典》2020版蔓荆子含量测定项下供试品溶液为原料液的指纹图谱，与已报道的蔓荆子指纹图谱研究中采用氯仿制备供试品溶液相比，所用溶剂仅为甲醇，溶剂毒性低，一步回流提取过滤即可，过程简单，结果重现性、稳定性良好，可作为《中国药典》收载蔓荆子药材及炮制品指纹图谱项目提供参考。

由指纹图谱可知，蔓荆子炒制前后指纹图谱相似度基本未改变，说明其化学成分炒制前后保持一致，质量属性保持一致。

由蔓荆子黄素含量可知，蔓荆子炒制后其蔓荆子黄素含量较生品均有所增加，说明炮制可以除去蔓荆子药材中的杂质，保留药效物质基础。