牛樟叶水提物对急性酒精性肝损伤的保护作用及其机制研究

张 蓓，余潇苓，万永艳，梁学政，徐 宏，覃开羽*

(1.柳州市中医医院，广西 柳州 545026；2.浙江中医药大学 第一临床医学院，浙江 杭州 310000)

牛樟分布于中国南部，为台湾地区特有树种，近年来被中国大陆地区多地引进栽培。其根皮、果、叶均可入药，但功效略有不同，牛樟叶功效以祛风除湿、止痛、杀虫为主[1]。现代研究主要以牛樟的无性繁殖、引种栽培、生长特性和分子鉴定为主[2-3]，药学部分仅见牛樟叶精油成分研究，其他药理、化学成分尚未见报道[4]。

嗜酒已成为世界性问题，肝脏是酒精代谢的主要器官，也是酒精诱导损伤的主要靶器官[5]，酒精性肝损伤是饮酒导致的肝脏疾病。随着现代生活节奏的加快，人们生活和工作的压力也逐渐增大，该类疾病发病率呈逐年上升趋势，并引起消化、循环、神经等系统病变，给人们带来的危害不容忽视[6]。急性酒精性肝损伤发病初期通常表现为脂肪肝，可发展为酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化，严重影响人们正常生活及工作[7-8]。酒精诱导的氧化应激是造成急性酒精性肝损伤的重要病理基础之一[9]。本研究以急性酒精性肝损伤为模型，考察牛樟叶水提物(AECL)抗酒精性肝损伤的药理作用机制。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

牛樟叶由柳州市天姿园艺有限公司提供，经广西中医药大学药学院杨柯教授鉴定为牛樟的叶子，标本保存于柳州市中医医院药学部标本室。

AECL制备：称取干燥牛樟叶10 kg，按物料30倍、20 倍、20 倍加水，加热提取3次，每次3 h，合并3 次滤液，常压加热浓缩至流浸膏，分装，4 ℃冰箱冷藏保存备用，流浸膏1 g相当于8.805 g牛樟叶。

实验动物：KM 小鼠，体质量(20±2) g，清洁级，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002。动物饲养于温度(23 ±2) ℃、相对湿度60%～ 65%、12 h 明暗交替环境，分笼饲养，标准饲料，自由进食饮水。

联苯双酯滴丸(万邦德制药集团股份有限公司，A02180412)；AST 试剂盒(20190807)、ALT 试剂盒(20190807)SOD 试剂盒(20190815)、GSH 试剂盒(20190220)、MDA 试剂盒(20180617)、TG 试剂盒(20190801)、BCA 试剂盒(20190815)均购自南京建成生物研究所。

1.2 实验仪器

全波长酶标仪(Epoch Biotek 公司，美国)；UV1780-5 紫外分光光度计(岛津企业管理中国有限公司)；岛津L600 台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；KQ5200B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 实验分组与给药

取健康KM小鼠，雌雄各半，体质量(20±2)g，按体质量随机分为6组，即正常组(NS)，模型组(NS)，联苯双酯组(200 mg/kg)，AELC高、中、低剂量组(20生药/kg、10生药/kg、5 g生药/kg)。每组10只，联苯双酯组和AECL组按20 mL/kg 给药容量灌胃给予相应药物，每日2 次，连续10 d，正常组和模型组给予等量生理盐水；末次给药0.5 h后，除正常组灌胃生理盐水外，其余各组小鼠按12 mL/kg 灌胃给予牛栏山二锅头白酒，随后禁食不禁水12 h 后，采血、取肝组织进行相应指标检测。

2.2 观察指标

肝脏匀浆或血清中ALT、AST、SOD、GSH、MDA、TG的测定严格按试剂盒说明书方法进行。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 AECL对酒精诱导急性肝损伤小鼠肝功能的影响

与正常组比较，模型对照组小鼠血清中ALT、AST和TG活性均明显提高(P<0.05)；与模型对照组比较，牛樟叶水提物高、中剂量组急性酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性和TG含量显著降低，两组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果见图1。

注：与模型组比较，*P<0.05。

3.2 AECL对酒精诱导急性肝损伤小鼠SOD活性的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清和肝组织中SOD 活性均明显降低(P<0.05)；与模型对照组比较，牛樟叶水提物高、中剂组血清中SOD 活性明显升高，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，高剂量能显著提高急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中SOD 活性(P<0.05)。见图2。

注：与模型组比较，*P<0.05。

3.3 AECL对酒精诱导急性肝损伤小鼠MDA 水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清和肝组织中MDA 水平均明显升高(P<0.05)；与模型对照组比较，牛樟叶水提物高剂量能显著降低急性酒精性肝损伤小鼠血清和肝组织中MDA 水平(P<0.05)。见图3。

3.4 AECL对酒精诱导急性肝损伤小鼠GSH 水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清和肝组织中GSH 水平均明显降低，两组间差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，牛樟叶水提物高、中剂量组小鼠血清和肝组织中GSH 水平明显升高(P<0.05)。见图4。

注：与模型组比较，*P<0.05。

注：与模型组比较，*P<0.05。

4 讨论

酒精性肝损伤是由于过量饮酒引起的肝脏代谢紊乱，主要包括酒精性脂肪肝、洒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。ALT和AST水平的变化是临床上评价肝损伤的重要指标[10]。本研究发现，与模型组比较，在牛樟叶水提物的高中剂量组的肝功能指标AST和ALT都有明显改善，说明牛樟叶水提物具有保肝作用。

酒精性氧化应激被认为是酒精性肝病的一个重要致病因素。机体大量摄入乙醇后，在乙醇脱氢酶(ADH)的催化下大量脱氢氧化，使三羧循环障碍和脂肪氧化减弱，影响脂肪代谢，致α-磷酸甘油增多而促进甘油三酯(TG)合成，TG是乙醇肝损伤的一个特征指标[11]。在本实验，牛樟叶水提物处理急性酒精诱导肝损伤小鼠后，血清和肝脏(数据尚未报道)中的TG明显降低，肝损伤显著改善。乙醇在肝脏氧化产生过多的氧化应激产物如氧自由基等，这些自由基可以激活磷脂酶及脂质过氧化反应，降解膜磷脂，改变其通透性和流动性。此外脂质过氧化还可影响DNA和蛋白质的结构和功能，直接参与对肝脏的损伤[12]。正常情况下，机体内存在自身抗氧化防御系统，SOD在清除自由基、维持还原氧化平衡中发挥着重要作用[13]。GSH是体内重要的抗氧化物质，是抗氧化酶GSH-Px的底物[14]。大量乙醇摄入使抗氧化物质耗竭，破坏机体的氧化和抗氧化平衡，引起氧化应激。MDA是主要的脂质过氧化终产物，其含量高低可反映机体内脂质过氧化程度，可间接反映自由基攻击机体细胞的严重程度[15]。本研究发现，牛樟叶水提物预先干预的小鼠，酒精诱导肝损伤后，与模型组相比，无论是血清还是肝组织中SOD的活性和GSH含量均明显提高，MDA含量明显降低，机体抗氧化能力显著增强。

综上所述，牛樟叶水提物可降低急性酒精性肝损伤模型小鼠血清ALT、AST及TG水平，牛樟叶水提取具有明显的保肝作用。进一步研究发现，牛樟叶可降低急性酒精性肝损伤模型小鼠肝组织中MDA含量，增强SOD活性和GSH含量，说明牛樟叶水提物可以增强机体清除自由基能力。牛樟叶的保肝作用可能与其增强机体抗氧化能力有关，具体机制还需要进一步研究。