HPLC测定栀黄消瘀止痛膏中大黄酚含量

鲁明明，林新艳，邬学群，莫 文，许金海，范赵翔，汤茹茹，殷书梅*

(1.江苏康缘阳光药业有限公司，江苏 南京 210046；2.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

栀黄消瘀止痛膏是在我国著名武术伤科大师王子平的经验方基础上改进而成的橡胶膏剂，处方由大黄、栀子、乳香、地鳖虫等六味中药组成，具有活血化瘀、消肿止痛的功效。临床用于跌打损伤初期、运动后急性软组织损伤、骨折肿痛剧烈属气滞血瘀证，证见以踝膝肘腕等关节肿痛为甚者，患者可在伤处出现青紫瘀斑或血肿，关节肿胀、活动受限等[1-2]。原制剂为软膏，临床采用药粉和饴糖搅拌均匀后直接涂布贴敷，不适宜长期存放，且患者反馈清洁度不佳，携带不方便。本制剂对处方药材进行合理提取后选用适宜基质形成橡胶膏剂，更符合临床需要。方中以大黄作为君药，其化学成分包含游离蒽醌衍生物、结合状蒽醌衍生物以及番泻叶苷A、B、C等，此外还含有鞣质类、有机酸类、挥发油类及植物甾醇等[3-4]。大黄临床上具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经之功效。本制剂选择活性成分大黄酚作为制剂质量控制指标，并建立了一种测定栀黄消瘀止痛膏中大黄酚含量的色谱方法，可对指标成分进行定量控制从而确保产品质量稳定及有效。现将实验过程报道如下。

1 实验材料

仪器：Agilest 1200(四元泵，VWD检测器)；Mettler AG135电子天平(梅特勒-托利多上海有限公司，十万分之一)；Mettler AB135S电子天平(梅特勒-托利多上海有限公司，十万分之一)；恒温水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司，型号HH-2)；超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司，型号KQ-500DE)；旋转蒸发仪(德国艾卡，型号IKA RV10)。试剂：甲醇-分析纯(南京化学试剂200106022H)；乙醇(南京化学试剂200211160H)；氯仿(南京化学试剂20115126D)；盐酸(南京化学试剂170811285H)；磷酸(南京化学试剂170310536D)；纯净水。对照品：大黄酚对照品(批号110796-201922，纯度99.4%，供含量测定，中国食品药品检定研究院)。样品：栀黄消瘀止痛膏(批号：200501、200502、200503，江苏康缘阳光药业有限公司生产)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

参照《中国药典》[5]2015年版一部“大黄药材含量测定”项下总蒽醌含量测定方法，对高效液相色谱条件进行优化，最终选定的色谱条件为：色谱柱岛津Wondasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温为35 ℃，流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20)，流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm，理论塔板数不低于3 000。色谱见图1、图2。

图1 对照品大黄酚色谱

图2 供试品溶液色谱

2.2 供试品制备方法

取贴膏2片，盖衬除去后将药膏刮下，混匀，取0.5 g，精密称定后置入具塞锥形瓶内，加入25 mL甲醇，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，减失的重量以甲醇补足，摇匀，滤过。精密移取提取液5 mL置入烧瓶中，将乙醇挥去，加入10 mL盐酸溶液(8%)，超声2 min，加入三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，取出，待冷后置入分液漏斗，烧瓶用适量三氯甲烷进行洗涤，转移至分液漏斗，分取三氯甲烷层，剩余酸液再用三氯甲烷提取3次，10 mL/次，合并三氯甲烷液，减压回收，残渣以甲醇溶解定容至10 mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取大黄酚对照品适量，精密称定，置100 mL量瓶中，以甲醇溶解定容，摇匀，配制成每1 mL含16.27 mg的储备液。精密吸取储备液，用甲醇作溶剂，配制成浓度为4.068、8.135、16.27、32.54、65.08 μg/mL的系列标准溶液。在“2.1”项色谱条件下(色谱柱为Wondasil，柱号为7H9701-21)，进样10 μL，重复2次，测定峰面积。以进样浓度(μg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行回归计算，即得大黄酚的线性回归方程为：Y=44.098X+0.567 9，相关系数R2= 1。实验结果表明：大黄酚在4.068～65.08 μg/mL浓度范围内呈良好线性，结果见表1。

表1 大黄酚的线性关系考察结果

2.3.2 精密度试验 精密吸取含大黄酚浓度为16.27 μg/mL的对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，每次10 μL，测定峰面积，计算相对标准偏差(RSD)为0.2%，仪器精密度良好，结果见表2。

表2 精密度试验结果 (n=6)

2.3.3 重复性试验 取样品1 g，精密称定，平行6份，制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算得出6份样品中大黄酚含量测定结果的RSD值为1.1%，显示重复性良好，结果见表3。

表3 重复性试验结果

2.3.4 稳定性试验 取“2.3.3”项下供试品溶液一份，分别在0、2、4、8、12、24 h依次注入高效液相色谱仪，记录大黄酚的峰面积，计算测定结果的RSD值为1.3%。实验结果表明：供试品溶液在24 h内稳定，结果见表4。

表4 供试品溶液稳定性考察结果

2.3.5 加样回收率试验 取本品(大黄酚含量1.66 mg/g)约1 g，平行9份，精密称定。上述样品每3份分为1组，每组分别按含大黄酚含量的0.5倍、1.0倍、1.5倍准确加入大黄酚对照品溶液，制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，并记录峰面积，计算加样回收率及RSD值。实验结果表明：大黄酚的加样回收率结果良好，结果见表5。

表5 加样回收率试验结果

2.4 样品含量测定

分别取3批中试栀黄消瘀止痛膏(批号：200501、200502、200503)各约1 g，精密称定，按“2.2”项下条件制备供试品溶液，并按照“2.1”项下色谱条件进样测定，计算制剂中大黄酚的含量，结果见表6。

表6 三批栀黄消瘀止痛膏中大黄酚的含量

3 讨论

流速考察：在流速分别为0.8 mL/min、1.0 mL/min和1.2 mL/min，其余色谱条件不变，对供试品溶液进样考察，结果表明，供试品溶液中的大黄酚色谱峰在上述三种流速下均能较好分离，说明不同流速条件下的耐用性较好；柱温考察：在柱温分别为30 ℃、35 ℃和40 ℃，其余色谱条件不变，对供试品溶液进样考察，结果表明，供试品溶液中的大黄酚色谱峰在上述三种柱温下的分离度无影响，说明不同温度的耐用性较好；色谱柱考察：在“2.1”项色谱条件下，选用不同品牌的色谱柱(Kromasil 100-5 C18、Epic C185u、Wondasil C18)，对供试品溶液进样考察，结果表明，分离度、理论塔板数均能够满足要求，说明耐用性较好；在大黄酚的含量测定中，分别考察了流动相甲醇-0.1%磷酸的比例95∶5、90∶10、85∶15及80∶20，分别进样分析，甲醇-0.1%磷酸(80∶20)流动相进样分析的色谱图中大黄酚的峰可以达到很好分离，且峰型较好。故选择确定流动相为甲醇-0.1%磷酸(80∶20)。检测波长选择：在紫外分光光度计下对大黄酚对照品溶液进行扫描，大黄酚最大吸收波长在220～230 nm区间内有最大吸收，但样品供试品溶液成分复杂，为避免其他物质影响，最终选择2015版药典“大黄”项下总蒽醌含量测定的波长254 nm，作为本方法的检测波长。

《本草新编》记载大黄性甚速，走而不守，善荡涤积滞、调中化食、通利水谷、推陈致新、导瘀血、破症结、散坚聚、止疼痛、败痈疽热毒、消肿胀，俱各如神。《日华子本草》提及大黄可“调血脉，利关节，泄塑滞”，外敷用于各类疮疖痈毒。历代医家以及《神农本草经》《纲目》《药性论》等对大黄的应用均有详细阐述：①积滞便秘；②血热吐衄，目赤咽肿：本品性味苦寒能降，可下泄上炎之火，具清热泻火、凉血止血之功；③跌扑损伤、热毒疮疡及水火烫伤；④瘀血证：下瘀血，清瘀热，能活血逐瘀通经，为临床骨伤科常用药物；⑤湿热证、淋证。文献报道大黄蒽醌类成分有较强的抑制PGE2及抑制MAPK级联系统的作用，表明大黄可通过抑制PGE2生成而产生抗炎作用[6]。另有报道，大黄外用具有显著的消炎、镇痛、抗菌等作用。本试验采用HPLC法对制剂中大黄酚成分开展了方法学考察，建立了适宜的色谱方法，通过三批中试样品进一步验证了大黄酚含量测定的稳定性。本试验样品200501-200503批次因使用的是同一批中间体生产，本品大黄酚含量为1.62 mg/g，考虑到转移率等问题，建议将含量初定为1.50 mg/g。后期跟进积累3～5批大黄原料所生产成品大黄酚含量，再确定具体值。同时对大黄原料及中间体分别建立内控标准，以确保产品质量的稳定性。