桃红四物汤醇提液的薄层分离与定性鉴别

宋天宝 尤斯涵 董明纲 郭春燕

1.河北北方学院，张家口，075000，中国

2.天津中医药大学，天津，301617，中国

桃红四物汤亦称加味四物汤，由桃仁、红花、当归、生地、白芍和川芎六味药组成。来源于《医宗金鉴·妇科心法要诀》（卷四十四），为调经药方之一，功效为调经止痛、活血化瘀、养血补血［1-2］，主治血虚兼血瘀症，是药性比较平和安全有效的活血祛瘀名方［3］。现代研究表明，桃红四物汤具有扩张血管、抗炎、抗疲劳、抗休克、抗过敏、降脂、调节免疫功能、补充微量元素等作用。桃红四物汤中含有多种有机成分，如：芳香酸、生物碱、多糖、黄酮、挥发油、单萜类糖苷、芳香族氰苷等，还含有氨基酸、维生素等人类必需的营养成分，以及无机成分铁、锌、铜、钴等元素［4］。目前，中药成分分析和质量控制方法有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、色谱-质谱联用、薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）等。TLC 与HPLC 和色谱-质谱联用相比较，具有样品预处理简单，仪器设备成本、耗材成本低廉；操作简便、直观性强、适用性广［5-6］等特点。TLC 可以几十个样品同时在一个薄层板上进行分离分析。通过紫外灯照射、显色、薄层扫描等方法鉴别含有特定官能团的物质［7］，与对照品结果比较，结合薄层扫描得到的光谱图和比移值，可以进行定性分析，在基层快检和中药分析中具有重要意义［8］。本研究采用薄层色谱法对桃红四物汤醇提液中的化学成分进行分离鉴别。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品

阿魏酸、羟基红花黄色素A、芍药苷对照品，购自中检所，纯度＞98%。

1.1.2 药材

桃仁，批号：20130321，河北；红花，批号：20140101，新疆；川芎，批号：20140401，四川；当归，批号：20130801，甘肃；生地，批号：20141203，山西；白芍，批号：20130401，安徽。

1.1.3 试剂

试剂乙醇（分析纯）、甲醇（分析纯），均购自天津市北方化玻购销中心；试剂正丁醇（分析纯），购自天津市风船化学试剂有限公司；试剂冰乙酸（分析纯），购自天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.1.4 主要仪器设备

硅胶G 薄层板，青岛海洋化工有限公司；薄层色谱展开缸，上海信谊仪器厂有限公司；SB-800DT 超声波清洗器，浙江省宁波市新芝生物科技股份公司；K-H3000 型薄层扫描仪，上海科哲生化科技有限公司；ZF-6 型三用紫外线分析仪，上海嘉鹏科技有限公司；LC-4012 低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；ME235P 电子分析天平，德国。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的制备

1.2.1.1 桃红四物汤醇提液及各单味药醇提液的制备参照国家中医药管理局会同国家药品监督管理局制定《古代经典名方目录（第一批）》目录中记载的桃红四物汤各单味药比例混合，以料液比1∶8 加入50%的乙醇超声提取30 min，离心，取上清液。采用同法，制备各单味药。稀释定容至适当浓度，备用。

1.2.1.2 对照样品的制备 电子天平精密称取羟基红花黄色素A 适量加50% 的甲醇溶解成2 mg·mL-1、芍药苷适量加50% 的甲醇溶解成2 mg·mL-1、阿魏酸适量加50% 的甲醇溶解成1 mg·mL-1，作为对照品备用。

1.2.2 醇提液的薄层分离和鉴别

硅胶G 薄层板（100 mm×200 mm）上分别点样桃红四物汤提取液、各单味药的提取液和上述对照品溶液，以正丁醇-冰乙酸-水（4∶1.5∶5，上层）为展开剂，展开、取出、晾干，置于紫外灯（365 nm）下检视，并进行下一步操作。

1.2.3 醇提液的薄层扫描和定性鉴别

在紫外灯（365 nm）下观察薄层板上的斑点，记录斑点位置。再将薄层板用碘蒸气显色，记录斑点位置，并对所有斑点进行薄层扫描，确定各个斑点的光谱特征和比移值。比较桃红四物汤醇提液、各单味药醇提液斑点和对照品的最大吸收波长、光谱特征和比移值，进行定性鉴别。

2 结果

2.1 桃红四物汤醇提液和各单味药薄层分离结果

桃红四物汤醇提液定性鉴别出5 个成分，其最大吸收波长和比移值见表1；依据吸收波长和比移值确定，有3 个成分分别为羟基红花黄色素A（来自红花）、芍药苷（来自白芍）、阿魏酸（来自当归和川芎）。另外，在桃红四物汤中有两个成分在组成桃红四物汤的各个单味药中均未检出。

表1 桃红四物汤醇提液和各单味药薄层分离结果

2.2 桃红四物汤已知化学成分对照品的薄层分析结果

2.2.1 羟基红花黄色素A 扫描结果

羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）对照品的扫描结果如图1-B，有2 个峰值吸收分别为351 nm、425 nm，1 个谷值吸收为383 nm；THSW-1（图1-A）、HH-1（图1-C）与HSYA（图1-B）的光谱特征完全一致，比移值均为0.34，见表2。

图1 HSYA 薄层扫描结果

2.2.2 芍药苷扫描结果

芍药苷对照品的扫描结果，如图2-B，有3 个峰值吸收分别为234 nm、293 nm、352 nm，2 个谷值吸收分别为260 nm、325 nm；THSW-4（图2-A）、BS-2（图2-C）与PF（图2-B）的光谱特征完全一致，比移值均为0.77，见表2。

表2 桃红四物汤薄层分离斑点的定性鉴别

图2 芍药苷（PF）薄层扫描结果

2.2.3 阿魏酸扫描结果

阿魏酸对照品的薄层扫描结果见图3-B，有2 个峰值吸收分别为228 nm、301 nm，1 个谷值吸收为251 nm，THSW-5（图3-A）、FA（图3-B）、CX-1（图3-C）和 DG-1（图3-D）的光谱特征完全一致，比移值均为0.97，见表2。

图3 FA 薄层扫描结果（A：THSW-5；B：FA；C：CX-1；D：DG-1）

2.3 薄层扫描结果分析

根据扫描结果，虽然桃红四物汤醇提液第二个斑点与红花醇提液第二个斑点的比移值相同为0.45，但是吸收光谱特征不同（图4），桃红四物汤有1 个峰值吸收为309 nm，1 个谷值吸收为240 nm；红花有2 个峰值吸收分别为218 nm、311 nm，1 个谷值吸收为238 nm，提示桃红四物汤醇提液第二个斑点可能为新产生的化学成分。

图4 THSW 和 HH 的薄层扫描（A：THSW；B：HH）

根据扫描结果，虽然桃红四物汤醇提液第三个斑点与川芎醇提液第一个斑点的比移值相同为0.51，但是吸收光谱特征不同（图5），桃红四物汤有1 个峰值吸收为273 nm，1 个谷值吸收为243 nm；川芎有3 个峰值吸收分别为227 nm、303 nm、439 nm，2 个谷值吸收分别为260 nm、395 nm，且在紫外灯（365 nm）照射下斑点颜色也不相同，在其它单味药中均未检出，提示桃红四物汤醇提液第三个斑点可能为新产生的化学成分。

图5 THSW 和 CX 的薄层扫描（A：THSW；B：CX）

3 讨论

本研究中桃红四物汤提取液的溶剂采用50%的乙醇，提取获得的化学成分为极性较大成分。薄层色谱展开中针对极性较大组分的常用展开剂有：正丁醇-冰乙醇-水（4∶1∶5，上层）、乙酸乙酯-正丁醇-水（4∶5∶1）、三氯甲烷-甲醇-水（65∶35∶10，下层）、三氯甲烷-甲醇（8∶1）［9］。本研究根据实际情况，在预实验中选择毒性较小和实验室较常用正丁醇-冰乙酸-水（4∶1∶5，上层）作为展开剂进行实验，但分离效果和比移值均不太理想。后调整展开剂中正丁醇-冰乙酸-水的比例，调整为正丁醇-冰乙酸-水（4∶1.5∶5，上层），展开结果效果较好。除去THSW-5 成分外，其它成分比移值在0.2～0.8 之间。

薄层色谱方法用于定性鉴别的特点：如果紫外光谱图轮廓一致并且比移值相同，可以初步断定为同一物质。如果紫外光谱图轮廓存在明显差异，可以断定肯定不是同一物质。本研究采用薄层色谱方法快速分离和初步鉴定了桃红四物汤中的几个化学成分。也肯定了合煎之后产生了新的物质，这是首次发现。实验结果验证了中医理论中的复方提取物合煎和单煎化学成分存在差异，也验证了合煎之后有新物质的产生。

尽管薄层色谱分离方法简单快速。但无法推断所产生的新的化学成分的结构。今后需采用制备薄层色谱后，结合紫外、红外、质谱和核磁进行进一步的结构鉴定。