水蛭抗凝血活性物质分析及水蛭素提取纯化的研究进展

孙 雨 王宇维 刘锦瑜 于佳源 赵荫腾 李继红

1.河北北方学院药学系，张家口，075000，中国

2.河北北方学院基础医学院，张家口，075000，中国

中药水蛭始载于《神农本草经》：“水蛭，味咸平。主逐恶血淤血，月闭，破血瘕积聚，无子，利水道。”说明药用水蛭具有破血、逐瘀等功效，经研究表明其具有抗凝血、抗血栓、降脂、抗肿瘤、抗细胞凋亡、抗炎等作用［1］，可用于治疗和预防各种心脑血管疾病、肿瘤、痛风、肾病等。在水蛭体内提取的水蛭素是一种酸性肽类化合物，是迄今世界上发现的最强的天然凝血酶抑制剂。在临床方面，水蛭素多用于治疗弥漫性血管内凝血（diffuse intravascular coagulation，DIC），不稳定性心绞痛（unstable angina，USA），急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AM），连续性肾脏替代治疗（continuous renal replacement therapy，CRRT）。国内外医疗行业正试图通过各种方式提取天然水蛭素，并将其开发成新一代高效特异性抗凝血、抗栓、抗肿瘤的药物。

水蛭体内含有多种抗凝血活性物质，水蛭素是其中的一种。不同种类的水蛭含有不同的抗凝血有效成分，这极大影响了提取方法和条件的选择。提取分离工作是开发利用水蛭素有效活性成分的基础，使用不同方法对实验结果也会产生不同影响。因此本文综述了几种常见水蛭中含有的抗凝血活性物质成分，并且对水蛭素的提取和纯化方法进行总结，旨在为高效快速提取水蛭素的方法的深入研究提供参考和借鉴。

1 不同品种水蛭抗凝血活性物质分析

1.1 日本医蛭（hirudo nipponica whitman）

日本医蛭是吸血水蛭，躯体内主要含水蛭素，但日本医蛭体型小，水蛭素总含量较少。日本医蛭躯体内含有和水蛭素结构相似，但是毫无抗凝血活性的伪水蛭素［2］。Markwardt 通过截取日本医蛭的头部或刺激唾液腺的方法提高了水蛭素纯度，推测真正的水蛭素可能主要存在于其头部或唾液腺中［3］。通过比较不同工艺条件对其抗凝血活性的影响，发现水蛭素受高温影响会严重失活，因此需要严格低温保存［4］。

1.2 宽体金线蛭（whitmania pigra）

宽体金线蛭属于非吸血水蛭，主要以螺、蚌等软体动物的体液为食。张彬等［5］曾认为此种非吸血水蛭体内可能不含水蛭素。近年来，程珊［6］采用 Native-PAGE与Western blot 结合的方法检测到宽体金线蛭体内含有与凝血酶结合的活性多肽，并且这种活性抗凝血多肽能与凝血酶形成不同比例稳定结合的蛋白质复合体，此外宽体金线蛭中还含有与凝血因子FⅩa、FⅨa 结合的活性多肽。这说明宽体金线蛭体内可能有非水蛭素类的抗凝血活性物质。

1.3 菲牛蛭（philippine cattle leech）

菲牛蛭和日本医蛭习性类似，主要以吸食人、畜血液为生。在菲牛蛭体内除发现水蛭素外，还发现另一种抗凝血活性物质—菲牛蛭素［7］，肖凌［8］对日本医蛭和菲牛蛭的活性成分做了LC-MS 分析，发现二者结构大致相同，药理学作用一致，但菲牛蛭素的抗凝血活性显著高于水蛭素［9］。菲牛蛭体型大，体内含有较多的菲牛蛭素［10］，且抗凝血活性并不会受人工养殖的影响［5］，未来这种水蛭可能是抗凝血活性物质提取的主要原料。

2 提取方法

水蛭素的提取方法主要分为两类，传统提取法（水提法、盐析沉淀法、有机溶剂提取法）和仿生诱导法，另外近些年来超声法和酶解法也被用于尝试提取水蛭素。

2.1 传统提取方法

水提法是用0.9%的生理盐水按四倍水蛭原液体积的比例进行粗提，并用10%～15%的三氯乙酸除去大量杂蛋白［11］，这种方法较为简便，成本低，能够保证蛋白质的活性，但是提取率很低。

盐析沉淀法是利用35%～55%饱和度硫酸铵盐［12］降低水蛭原液中蛋白质的溶解度使之沉淀，以此达到粗提的目的，尽管蛋白质的提取率不是很高，但水蛭素的活性较高。通过正交实验进一步研究确定利用40%饱和度硫酸铵将水蛭原液在pH 为5.5 的环境中静置20 min后分离［13］，可以达到此方法的最高提取效率。

有机溶剂提取法就是利用醇、丙酮等作为提取溶剂。常用含水15 %的丙酮溶液（-20℃冰箱预冷）浸泡水蛭原液过夜，使得蛋白质分子充分聚集，再通过离心保留聚沉的蛋白质。这种方法具有较高的提取率，但是这种方法很容易导致蛋白失活。

2.2 仿生诱导法

仿生诱导法［14］是对水蛭活体进行诱导使其分泌唾液，再对唾液进行分离提纯，这种方法避免了传统方法对水蛭素的一次性掠夺，保护了水蛭的野生资源，又带动了水蛭养殖业的发展。诱导的方法通常分为两种，一种是利用化学物质进行诱导，能够刺激鲜活菲牛蛭使其分泌出唾液的化学物质包括无机盐、有机酸和浓度较低的无机酸，酸溶液浓度为0.1%～3%，PH 在4.5～6.8之间［15］。其中田丽华［16］研究发现用氯化钠配合L-精氨酸对水蛭的诱导效果较好。

另一种是生物诱导方法，即利用猪血、田螺等构成诱导系统，对水蛭进行数天饥饿处理后，在室温中性环境下对水蛭活体进行诱导［17］。生物诱导系统由蚯蚓提取液、壳聚糖、黄芪多糖、葡萄糖粉组成，随后利用硫酸锌与乙醇的混合液组成的催吐剂进行催吐。

2.3 超声提取法

超声提取法是将水蛭用组织匀浆机匀浆后，放入生理盐水稀释后，用20～25 KHz 的超声波粉碎，再用三氯乙酸提取蛋白［18］。在传统的匀浆实验中发现，大部分细胞还未完全裂解，大量的水蛭素还存留在匀浆液中的水蛭体内，采用超声波超微破碎处理迅速破坏细胞，使得提取水蛭素效率大大提高［18］。

2.4 酶解法

酶解法［19］是以蛋白质作为原料，再利用合适的蛋白酶对这些蛋白进行水解，把其中的生物活性肽段释放出来。侯会会在酶解法的基础上做了创新，用碱性蛋白酶酶解法提取水蛭素，将蛋白类大分子水解成具有一定活性的小分子物质，从而获得较高的提取效率［19］。由于此方法的高安全性以及蛋白原料的可选择性，使其在医疗行业具有优良的研究前景。

3 纯化方法

水蛭素的纯化主要利用阴离子交换层析法、凝胶过滤色谱法、反相高效液相色谱法、超滤法、双水相萃取法以及近年来兴起的酶固定化法和特异性结合的方法等，各种纯化方法对水蛭的纯化程度也都不一样。水蛭素的纯度直接影响其疗效，但是纯度的提高必然会使提纯的工艺更加繁琐，因此找到合适的提纯工艺至关重要。

3.1 阴离子交换色谱法

阴离子交换色谱法是水蛭素分离提纯应用最广的方法。DEAE-C52 纤维柱［20］和Q Sepharose 快速层析柱［21］都可以对水蛭素进行洗脱，收集每个峰的成分，并检测每个峰的活性。此外冯会藏［22］等基于传统的阴离子柱层析法做了改进，采用孔径更大的DEAE-硅胶分离柱，用纯盐溶液作流动相，通过调节流动相离子浓度进行梯度洗脱提纯。这种方法分离特异性好，容易操作，但是需要后期除盐。

3.2 凝胶过滤色谱法

凝胶过滤色谱法是利用蛋白质分子量的大小进行分离纯化，一般先用Sephadex G-75 凝胶过滤柱对水蛭素粗品洗脱分离，接着用Sephadex G-25 层析柱完成脱盐处理［20］。这种方法可用于蛋白分离和脱盐，但收集到的抗凝血活性物质比较少，并且洗脱后的样品会被大量稀释，降低了最终活性物质的纯度，因此用这种方法纯化后需要浓缩处理。

3.3 反向高效液相色谱法

反向高效液相色谱是由非极性固定相十八烷基键合硅胶和甲醇、乙腈等极性流动相所组成的色谱体系，与高效液相色谱体系组成相反，能更好地调整分离效果，可用于水蛭素的进一步纯化和含量测定。段超［14］等用经Sephadex G-25 凝胶过滤后的提纯液，采用含有0.1%三氟乙酸的乙腈水溶液洗脱提纯，收集活性峰所在处的成分，得到更高纯度的水蛭素。

3.4 超滤提纯法

超滤提纯就是利用聚砜膜滤过技术，对水蛭素进行分离，通常利用聚砜PS1（截留分子量10 000）和PS2（截留分子量5 000），段超用此方法在0.20MPa 的氮气压下超滤［14］，这种分离蛋白的方法效率较高，容易操作，但是后续的膜清洗比较困难，若清洗不干净会影响后续物质的分离。

3.5 双水相萃取法

双水相萃取［23］是将化学结构不同的亲水性聚合物形成互不相溶的上、下两相，利用目的物在两相的分配差异而进行萃取的技术。方富永［24］用双水相萃取-凝胶色谱联用的方法纯化水蛭素粗提液得到纯度较高的产品。此方法分离条件温和、成本低、具有良好的研究前景。

3.6 酶固定化法

酶的固定化是用固体材料将酶固定在一定区域内，使其进行可重复性催化反应。苗艳丽等人采用丝素固定化凝血酶法［25］以脱胶家蚕丝素为载体，以戊二醛为交联剂分离纯化菲牛蛭中的水蛭素，迅速分离出高纯的水蛭素。这种方法在工业生产中具有优良前景。

3.7 特异性结合法

特异性结合法基于生物亲和的方法，是近年来用于快速筛选和鉴定复杂物质中的特定目标的新方法。原理是生物分子之间的可逆相互作用，在配体和蛋白质之间发生亲和相互作用后，THR 和配体被解离和洗脱，而未与目标结合的化合物将被丢弃。QY Huang 等人用此原理从水蛭中发现一种新型凝血酶抑制肽［26］，此后QY Huang 以凝血酶为靶向物质，用亲和超滤和UPLC-HR-Orbitrap-MS 的方法从菲牛蛭体内筛选出了具有抗凝血活性的凝血酶靶向小分子［27］。这种方法可以筛选具有可逆性的组件与靶蛋白的结合效应，对目标具有亲和力的化合物将被获取并进一步分析。

4 小结与展望

水蛭素作为目前所发现的最强的天然抗凝血酶活性物质，其开发及利用受到医疗行业的重视。通过比较分析三种常见的水蛭，其中菲牛蛭体内的菲牛蛭素与水蛭素药理作用相同，结构相似，此外菲牛蛭素的抗凝血活性优于水蛭素，同时菲牛蛭体型大、生存能力较强，可节约原料成本，极具研究前景。仿生诱导水蛭素的方法简便可行，与其他传统方法相比，此方法为水蛭素的持续利用提供了道路，既保护了水蛭的资源，也为水蛭素的产业化提供了便利。在水蛭素纯化阶段可以看出，分离纯化步骤越多，产品的损耗也就越大。在工业生产上，人们应向着分离纯化有合理的成本和效率等方面发展，同时要保留水蛭素的结构完整性及其生物的活性。

国内外通过基因工程技术获得与天然水蛭素极其相似的重组水蛭素，并且注射和口服均可发挥药效，可它在63 位酪氨酸残基处未磺酸化，这使得重组水蛭素对凝血酶的抑制效果较天然水蛭素大幅度降低，临床效果也低于天然水蛭素［28］。因此，对于开发新的重组水蛭及其他水蛭肽类衍生物也还有很远的路程。