针叶樱桃浓缩物及其配伍组合物的抗炎作用研究

张晴，赵雪姣，童玲，曹翠峰，胡文均，申若男，刘雪纯，杜守颖，陆洋,3

（1.北京中医药大学中药学院，北京 100029；2.浙江养生堂天然药物研究所有限公司，浙江杭州310024；3.深圳北京中医药大学研究院，广东深圳 518000）

普通感冒是最常见的急性呼吸道感染性疾病，成人每年患普通感冒平均2~6次，儿童平均6~8次。其中鼻病毒是引起普通感冒最常见的病原体[1]，多数普通感冒患者会出现鼻塞、流鼻涕和打喷嚏等急性炎症症状[2]。

目前维生素C已在多种病毒感染与炎性疾病的辅助治疗中被广泛应用[3]。范增顺等应用大剂量维生素C，使病毒性感冒早期患者的症状得到缓解[4]。现代研究证明，大剂量维生素C在抗病毒方面的疗效可能与其提高白细胞对病毒的抵抗力、诱导体内产生干扰素和抗氧化等作用相关[5]。针叶樱桃是金虎尾科金虎尾属凹缘金虎尾Malpighia EmarginataDC.的果实，维生素C含量高达2 440 mg/100 g，素有“维生素C之王”的美誉。除富含维生素C外，针叶樱桃还含有总黄酮1 700 mg/100 g，类胡萝卜素1 410~4 060μg/100 g以及多种维生素、矿物质[6]。

本研究通过建立二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型和乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高模型，研究不同剂量针叶樱桃浓缩物的抗炎作用；选择具有抗炎效果剂量的针叶樱桃浓缩物，分别与具有抗感冒认知的接骨木莓[7]+野樱莓[8]、接骨木莓+葡萄糖酸锌[9]配伍成2种组合物，并考察其抗炎作用，从抗炎的角度探讨针叶樱桃浓缩物辅助治疗普通感冒的作用机制，以及接骨木莓与野樱莓或葡萄糖酸锌的协同作用。

1 材料

1.1 动物

健康雄性ICR小鼠240只，体质量(20±2)g，斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019‑0010。

1.2 药物及试剂

针叶樱桃浓缩物（浙江安吉优果果业有限公司，维生素C含量：16.5%，20180529）；接骨木莓浓缩果汁粉（总花青素：12.23%，总多酚：17.96%，IProna SpA，1801302530）；野樱莓（黑果腺肋花楸果）浓缩果汁粉（总花青素：8%，总多酚：15.88%，IProna SpA，1801312281）；葡萄糖酸锌（郑州瑞普生物工程有限公司，20181011054）；二甲苯（天津恒兴试剂有限公司，20180108）；吲哚美辛（山西云鹏制药有限公司，A14070）；乙酸（上海申汕化工有限公司，20180216）；TNF‑α（美国R&D公司，MTA00B）；IL‑1β（美国R&D公司，MLB00C）；伊文思蓝（上海新中化学厂，1640202）。

1.3 主要仪器

UV‑2550紫外可见分光光度仪（岛津）；Synergy H1全功能酶标仪（美国Biotek公司）；6 mm耳片打孔冲头；D‑37520 Biofuge高速离心机（德国kendro公司）；XS204S型电子天平（梅特勒‑托利多仪器有限公司）。

2 方法

2.1 针叶樱桃浓缩物的抗炎作用

2.1.1 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验 将60只雄性ICR小鼠随机分为6组，分别为空白组（生理盐水20 mL/kg）、模型组（生理盐水20 mL/kg）、阳性药对照组（吲哚美辛20 mg/kg）、针叶樱桃浓缩物低、中、高剂量组（303、505、1 010 mg/kg）。阳性药对照组按其给药剂量连续灌胃给药3 d，其余组别按其给药剂量连续灌胃给药7 d。末次给药1 h后，在小鼠左耳正反面均匀涂抹二甲苯20μL致炎，空白组不作处理。30 min后，眼眦取血，断颈处死，剪下小鼠左、右两耳，在相同位置用打孔器打下两圆形耳片，称重，计算肿胀度及肿胀抑制率。

肿胀度=左耳质量−右耳质量

肿胀抑制率=(模型组平均肿胀度−给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度×100%

取耳廓肿胀模型小鼠血液，以3 500 r/min的转速于4℃离心10 min，分离血清，采用ELISA方法检测TNF‑α和IL‑1β的含量，具体方法见试剂盒说明书。

2.1.2 乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高实验分组方法同“2.1.1”项。阳性药对照组（吲哚美辛40 mg/kg）连续灌胃给药1 d，其余组别按其给药剂量连续灌胃给药7 d。末次给药30 min后，各组别小鼠均尾静脉注射0.5%伊文思蓝溶液（10 mg/kg）。5 min后，空白组腹腔注射生理盐水（10 mg/kg），其余组别腹腔注射等剂量1%乙酸溶液。20 min后，断颈处死，腹腔注射5 mL生理盐水进行洗涤，轻揉小鼠腹部，剪开腹腔，吸取洗涤液，以3 500 r/min转速离心10 min，取上清液于紫外分光光度计590 nm比色，以吸光度（A）表示小鼠腹腔毛细血管的通透性。

给药组抑制率=(A0−A1)/A0×100%

（A0：模型组吸光度平均值；A1：给药组吸光度平均值）

2.2 2种针叶樱桃组合物的抗炎作用

选择具有抗炎效果的针叶樱桃浓缩物剂量，分别与接骨木莓（8.3 mg/kg）+野樱莓（8.3 mg/kg）、接骨木莓（8.3 mg/kg）+葡萄糖酸锌（7.0 mg/kg）配伍成2种针叶樱桃组合物，分别称为组合物1、组合物2，采用“2.1.1”项下和“2.1.2”项下动物实验进行抗炎作用考察。

2.3 统计学方法

以SPSS 22.0软件进行数据处理，实验数据用（±s）表示。先进行正态性检验：若数据为正态分布，比较多组数据，选用单因素方差分析；比较组间数据，方差齐选用LSD检验方法；方差不齐则选用Games‑Howell检验方法；若数据为非正态分布，选用非参数检验方法。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 针叶樱桃浓缩物的抗炎作用

3.1.1 针叶樱桃浓缩物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 表1结果显示：与模型组比较，针叶樱桃浓缩物各剂量组均能够抑制小鼠耳廓肿胀（P<0.01），其作用效果随剂量升高而降低；针叶樱桃浓缩物低剂量组与中、高剂量组比较，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；中、高剂量组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。针叶樱桃浓缩物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀具有抑制作用。

表1 针叶樱桃浓缩物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响Table 1 Effect of acerola conc.powder on xylene‑induced ear swelling in mice(xˉ±s,n=10)

3.1.2 针叶樱桃浓缩物对耳廓肿胀模型小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β含量的影响 图1结果显示：对比空白组，模型组小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β的含量显著升高（P<0.05，P<0.01）。对比模型组，针叶樱桃浓缩物各剂量组及阳性药对照组小鼠血清中TNF‑α的含量有所降低，但其差异均无统计学意义（P>0.05）；针叶樱桃浓缩物各剂量组小鼠血清中IL‑1β的含量显著降低（P<0.05，P<0.01）。针叶樱桃浓缩物各剂量组小鼠血清中IL‑1β的含量与阳性药对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。针叶樱桃浓缩物能较好抑制二甲苯诱导的促炎因子的释放。

图1 针叶樱桃浓缩物对耳廓肿胀模型小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β含量的影响Figure 1 Effect of acerola conc.powder on the content of TNF‑αand IL‑1βin serum of mice with ear swelling model

3.1.3 针叶樱桃浓缩物对乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响 表2结果显示：对比空白组，模型组小鼠腹腔毛细血管通透性显著增高（P<0.01）；对比模型组，针叶樱桃浓缩物各剂量组可显著性抑制小鼠腹腔毛细血管通透性增高（P<0.05）；针叶樱桃浓缩物对乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高具有抑制效果。

表2 针叶樱桃浓缩物对乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响Table 2 Effect of acerola conc.powder on the increase of peritoneal capillary permeability in mice induced by ace‑tic acid(xˉ±s,n=10)

3.2 2种针叶樱桃组合物的抗炎作用

根据“3.1”实验结果，针叶樱桃浓缩物各剂量组均有抗炎作用，呈剂量依赖性，低剂量组与中、高剂量组相比差异有统计学意义，因此选取针叶樱桃浓缩物低剂量组配伍制得组合物1和组合物2，并与针叶樱桃浓缩物低剂量组及中剂量组抗炎效果进行比较。

3.2.1 2种针叶樱桃组合物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 表3结果显示：与模型组比较，其余组别均可抑制小鼠耳廓肿胀（P<0.01）；对比针叶樱桃浓缩物低剂量组，针叶樱桃浓缩物中剂量组、组合物1、组合物2差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；2种组合物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀具有抑制效果，接骨木莓与野樱莓或葡萄糖酸锌具有协同增效作用。

表3 2种针叶樱桃组合物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响Table 3 Effect of two acerola compositions on xylene‑in‑duced ear swelling in mice(xˉ±s,n=10)

3.2.2 2种针叶樱桃组合物对耳廓肿胀模型小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β含量的影响 图2结果显示：对比空白组，模型组小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β的含量显著增高（P<0.05，P<0.01）；对比模型组，其余组别小鼠血清中TNF‑α的含量差异无统计学意义（P>0.05），IL‑1β的含量显著降低（P<0.01）。2种组合物能较好抑制二甲苯诱导的促炎因子释放。

图2 2种针叶樱桃组合物对耳廓肿胀模型小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β含量的影响Figure 2 Effect of two acerola compositions on serum TNF‑α and IL‑1βin mice with ear swelling model

3.2.3 2种针叶樱桃组合物对乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响 表4结果显示：对比空白组，模型组小鼠腹腔毛细血管通透性显著增高（P<0.01）；对比模型组，其余组别均可显著抑制小鼠腹毛细血管通透性增高（P<0.05）。2种组合物对乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高有抑制效果。

表4 2种针叶樱桃组合物对乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响Table 4 Effect of two acerola compositions on the increase of peritoneal capillary permeability in mice induced by ace‑tic acid(xˉ±s,n=10)

4 讨论

普通感冒大部分是由病毒引起的，当病毒到达咽喉部腺体区时，病毒与气道上皮细胞特异性结合[10]。病毒在呼吸道的上皮细胞及局部淋巴组织中复制，引起细胞病变及炎症反应，病毒感染后释放的炎性介质包括激肽、白三烯、白介素和TNF等，导致血管通透性增加，使血浆渗入鼻黏膜，鼻腔腺体分泌增加，出现流清涕、鼻塞等呼吸道症状，并产生发热、全身疼痛等全身症状[1]。炎症反应是具备血管系统的活体组织对损伤因子产生的一种防御反应，TNF‑α和白介素‑1β是其中的关键性促炎因子。TNF‑α指由单核细胞、巨噬细胞受到促炎因子的刺激后所生成的一种促炎性蛋白[11]；白介素‑1β指由巨噬细胞、单核细胞和淋巴细胞所产生的促炎因子，起到介导多种炎症反应及诱导促炎因子的表达、分泌的作用[12]。

针叶樱桃浓缩物除有高含量的天然来源维生素C外，还富含多种具有活性的营养素，国外已有一些临床研究证明其对缓解炎症具有一定作用。接骨木莓富含多酚及花青素，在民间用于治疗流感、感冒和鼻窦炎等已有数百年的历史[7]。野樱莓含花青素、黄酮、多酚等多种营养物质，具有抗氧化、抗炎、抗菌、降血糖、防治心脑血管疾病等药理作用，多应用于治疗皮肤疾病、感冒及视力改善[8]。葡萄糖酸锌可以提高机体的免疫力，常应用于缺锌引起的发育缓慢、营养不良等症，还可用于治疗感冒、口腔溃疡等[9]。

基于此，本研究将针叶樱桃浓缩物与接骨木莓、野樱莓、葡萄糖酸锌进行配伍组合，开展抗炎作用研究。本研究选定应用较多且技术较为成熟的两种抗炎药理模型，进行抗炎作用研究。与模型组比较，针叶樱桃浓缩物及其组合物均能使小鼠耳廓肿胀度和血管通透性显著降低，具有确切的抗炎效果。本研究进一步通过检测相关促炎因子的表达水平探讨其作用机制，结果显示，与模型组比较，针叶樱桃浓缩物及其组合物小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β的含量均降低，后者较为显著，提示针叶樱桃浓缩物及其组合物的抗炎作用与其能够抑制促炎因子TNF‑α、IL‑1β的释放有密切关系。

综上所述，针叶樱桃浓缩物有较好的抗炎作用，接骨木莓与野樱莓或葡萄糖酸锌具有协同增效作用，其作用机制可能与其抑制促炎因子TNF‑α、IL‑1β等的释放有密切关系。本研究为应用针叶樱桃浓缩物辅助治疗普通感冒提供了实验基础。